草莓根腐病病原菌分离与鉴定

凤舞剑，朱 强，白耀博，曹 丹，陶佩琳

（1.徐州生物工程职业技术学院/徐州市现代农业生物技术重点实验室，江苏 徐州 221006；2.江苏海洋大学食品科学与工程学院，江苏 连云港 222005）

草莓因种植周期短、见效快、收益高，而被广泛种植，同时也深受消费者喜欢。江苏作为草莓发展重点省份，种植规模与产量均居全国前列[1]，尤其是近几年来江苏各地着力发展草莓产业，主要以镇江市句容市、连云港市东海县、徐州市贾汪区及铜山区等为中心，打造出多个草莓特色小镇，如徐州市贾汪区耿集镇“莓好田园”现代农业生态小镇、徐州市铜山台上草莓特色小镇等[2]。徐州地区草莓生产规模已达2.3万hm2，栽培模式主要以保护地为主，因连作时间长、管理粗放，导致土传病害严重，主要表现在草莓苗定植后根腐病大发生，导致大面积缺苗或断垄，给种植户生产带来较大的损失，严重阻碍了草莓产业的发展。目前，草莓根腐病致病菌种类多且分布广，徐州地区草莓根腐病致病菌病原尚未有报道。因此，筛选、分离及鉴定徐州地区根腐病病原菌种类，为预防草莓根腐病的防控提供科学的依据，对于指导当地草莓生产实践、推动草莓产业绿色防控具有重要的意义。

1 材料和方法

1.1 样品的采集

样本采集于江苏省徐州市徐州安耕现代农业科技示范园草莓种植基地，经徐州市现代农业生物技术重点实验室李文红教授鉴定其为典型根腐病病株。

1.2 病原菌的分离与纯化

取典型病株切取根部，用自来水反复冲洗至洁净无杂质，将病变组织切成1 cm×1 cm块状。用无菌镊夹取病块组织置于75%乙醇溶液中浸泡30 s，取出用无菌水冲洗干净，放置于0.1%氯化汞溶液中浸泡2 min，取出后用无菌水冲洗干净，然后用无菌纱布擦拭掉水分。用无菌解剖刀将病组织块切成5 mm×5 mm规格，放于PDA培养基上在恒温25 ℃室内暗条件下培养5 d[3]。自菌落边缘挑取不同形态菌丝进行分离培养[4]，纯化后于恒温箱中保存。

1.3 病原菌的鉴定

1.3.1 病原菌形态学鉴定

采用平板扦片法[5]。将菌株XZ-D01置于PDA培养基上并进行25 ℃恒温培养，在菌丝生长初期插入已灭菌的盖玻片，5 d后菌丝延伸至盖玻片上，用乳酸石炭酸棉蓝染色液染色后挑取菌丝并制作水浸片，用显微镜观察菌丝生长情况及其形态特征。

1.3.2 病原菌分子生物学鉴定

挑取病原体，经培养后提取DNA[6]再进行PCR扩增，获取产物经琼脂糖凝胶电泳分离后送至生工生物工程（上海）股份有限公司测定碱基序列，将获得的序列存储于NCBI网站并提交至GenBank数据库，采用BLAST软件，比对病原菌碱基序列与其他草莓根腐病病原菌碱基序列同源性[7]，最后借助MEGA 7.0软件构建rDNA-ITS序列系统进化树。

2 结果与分析

2.1 草莓根腐病病原菌的分离

采用组织分离法，从徐州市贾汪区“莓好田园”现代农业产业园草莓生产基地根腐病害植株（图1-a、图1-b）上共分离出细菌4株（图1-c），真菌11株（图1-d）；其中，5株真菌表达出典型的根腐病病原菌致病特征，分别命名为CMGF-1、CMGF-2、CMGF-3、CMGF-4、CMGF-5。

图1 草莓根腐病病株及病原菌的分离

2.2 草莓根腐病病原菌的鉴定

2.2.1 菌落形态学鉴定

由图2可知，菌株CMGF-1—GMGF-5中有3株产菌核，3株产色素，5株初生菌丝均为白色，生长迅速（5 d可铺满平板）；5株气生菌丝发达，空间伸展力强；其中，CMGF-4生长速度最快，气生菌丝呈丝绒状；3株菌落辐射呈环状，2株菌落边缘呈不规则状，详述如表1，CMGF-1：边缘整齐，有白色、发达的气生菌丝，产黑色菌核，不产色素，呈环状辐射；CMGF-2：边缘参差不齐，气生菌丝发达且显白色，产黑色菌核，产黄色素，外缘生菌丝呈黄色，内缘生菌丝呈白色，无辐射状；CMGF-3：边缘参差不齐，气生菌丝发达且呈白色，产黄色素，无辐射状；CMGF-4：边缘齐整，气生菌丝发达且呈白色，产黑紫色素，不产菌核，呈环状辐射；CMGF-5：边缘整齐，气生菌丝发达呈白色，不产色素且无菌核，呈环状辐射。

表1 菌落形态

图2 CMGF-1—CMGF-5菌落形态学特征（5 d）

2.2.2 微观形态学鉴定

由图3可知：CMGF-1是无隔膜、无颜色的气生菌丝，分生孢子梗直立，产孢于分生孢子座上，分生孢子短杆状，无隔膜，脱落孢子盘呈簇状。

图3 CMGF-1微观形态观察（40×10倍）

由图4可知：CMGF-2和CMGF-3是细长、弯曲的气生菌丝，有隔膜，隔膜处有缢缩，产生纺锤形分生孢子，顶端无附属丝，脱落后可见葡萄状孢子盘。这2个菌株微观形态极其相似，比对图2菌落形态学特征，可判定其为同属，是否为同种尚需进一步研究。

图4 CMGF-2和CMGF-3微观形态观察（40×10倍）

由图5可知：CMGF-4细长笔直的气生菌丝无隔膜，产球状分生孢子，单梗产圆钝形孢子，分布于两侧，释放后呈较为典型镰刀状。依据《真菌鉴定手册》[8]可初步诊断为串珠镰刀菌。

图5 CMGF-4微观形态观察（40×10倍）

由图6可知：CMGF-5直而长的气生菌丝无隔膜，单梗产圆钝孢子，释放后孢子细长且两端尖锐，呈镰刀状。依据《真菌鉴定手册》[8]可初步诊断为尖孢镰刀菌。

图6 CMGF-5微观形态观察（40×10倍）

2.2.3 分子生物学鉴定

由图7可知：CMGF-1与K C010547.1Colletotrichum gloeosporioides在进化树中最近缘，可鉴别为同种，则CMGF-1为胶孢炭疽菌，近缘性为58%。

图7 CMGF-1系统进化树

由图8可知：CMGF-2与K Y_606543.1Neopestalotiopsis clavispora在进化树中最近缘，可鉴别为同种，则CMGF-2为棒孢拟盘多毛孢，近缘性高达87%。

图8 CMGF-2系统进化树

由图9可知：CMGF-3与K R_052094.1Neopestalotiopsis clavispora在进化树中最近缘，可鉴别为同种，则CMGF-3为棒孢拟盘多毛孢，近缘性为58%。图8和图9系统进化树进一步验证了CMGF-2和CMGF-3菌株的近缘性，可推断出这2个菌株属于同种的2个亚种。

图9 CMGF-3系统进化树

由图10可知：CMGF-4与NR_159818.1Fusarium continuum在进化树中最近缘，可鉴别为同种，则CMGF-4为串珠镰刀菌，近缘性达91%，进一步验证了2.2.2形态学鉴定的结论。

图10 菌株CMGF-4系统进化树

CMGF-5的分子生物学鉴定结果同CMGF-4。

3 结论与讨论

本研究采用组织分离法，从江苏省徐州市贾汪区“莓好田园”现代农业产业园草莓生产基地取样，通过分离、纯化，从大量感病植株病原菌落中获取了5个真菌菌株，经形态学甄别与分子生物学碱基序列测定，鉴定结论是：CMGF-1是胶孢炭疽菌或其亚种，CMGF-2、CMGF-3是棒孢拟盘多毛孢或其亚种，CMGF-4是串珠镰刀菌或其亚种，CMGF-5是尖孢镰刀菌或其亚种。徐州地区草莓根腐病病原菌是由多种病原菌长期适应连作生境而进化的结果。目前国内草莓根腐病致病菌多达20种[9-15]，症状表达具有多样化。从徐州地区草莓根腐症状表达上来看，草莓黑根根腐致病菌是镰刀菌和拟盘多毛孢菌，此类发病率高、危害重；其次，草莓红中柱根腐致病菌是病原菌胶孢炭疽菌。不同的区位环境可能会导致病原菌的基因构型及致病力差异化，基于rDNA-ITS序列分析低缘性关系与此是否具有相关性，尚需进一步研究。