光诱导漆酶催化二氧化碳还原

郑丹丹 张颖 刘晓红 王江云

摘要 漆酶CueO是一种含有4个铜原子的多铜氧化酶，是一种环境友好型酶，可以参与木质素的降解，并催化多种芳胺类小分子化合物的氧化。本文以E.coli BL21为表达菌株，优化表达条件，证明CueO的基因可以在大肠杆菌中异源重组表达。通过镍柱亲和层析法和分子排阻层析法纯化得到了目的蛋白，表达量为40 mg/L。采用电感耦合等离子体-原子发射光谱及铜配位显色的方法计算了CueO中的铜嵌入率。最后，以CueO作为催化剂，钌（II）-三联吡啶金属配合物[Ru（bpy）3]2+作光敏剂，同时抗坏血酸钠作为牺牲还原剂，在可见光照射15 h后，气相色谱检验该体系可将CO2还原为CO，催化反应的转换数（TON）值为192。该体系是以水为溶剂，避免了有机溶剂的使用。此外，通过对CueO进行点突变，还可以改变光催化CO2还原活性。

关 键 词 光催化;二氧化碳还原;漆酶（CueO）;光敏剂;一氧化碳

中图分类号 O644.1     文献标志码 A

Abstract Laccase， CueO， is a multicopper oxidase containing four copper atoms. It is an environmental- friendly enzyme that can participate in lignin degradation and catalyze the oxidation of many small aromatic amines. Using E. coli BL21 as an expression strain， it has proved that CueO gene can be expressed heterologously in E. coli by optimizing expression conditions. The target protein was purified by nickel-affinity chromatography and molecular exclusion chromatography with the expression yield of 40 mg/L. The copper atom embedding efficiency in CueO was calculated by ICP-MS and copper atom coordination color development. Finally， using CueO as catalyst， ruthenium（II）-dipyridine metal complex was used as photosensitizer and sodium ascorbate was used as sacrificial reductant. After 15 hours of visible light irradiation， the gas chromatography shows that the system can reduce CO2 to CO， and the turnover number （TON） of the catalytic reaction is 192. The system uses water as solvent and avoids the use of organic solvent. In addition， the photocatalytic CO2 reduction activity can be changed by point mutation of CueO.

Key words photocatalytic; CO2 reduction; laccase （CueO）; photosensitizer; CO

0 引言

工业革命之后，人类活动排放了大量CO2等温室气体，使得温室效应不断加剧[1]，并导致了冰川融化，极端气候等环境问题。近年来，世界各国在减少CO2排放方面做出了许多努力，积极研发绿色可持续能源，同时科学研究者也致力于捕获和回收利用CO2[2]。目前，利用可见光驱动的光化学反应产生可再生资源是解决能源和环境问题的一种潜在策略。

基于自然界光合作用的原理[3]设计的人工模拟光合作用系统可以有效地捕获、储存和利用CO2。可见光驱动的CO2还原反应系统一般主要包括光敏剂、电子供体和催化剂。而发展金属配合物催化劑进行光催化还原CO2是太阳能燃料生产的重要前沿。最近，以Mn[4]，Fe[5-10]，Co[11-14]，Ni[15-17]，Cu[18-26]等一系列过渡金属为基础的分子催化剂已经被用来研究光催化CO2还原。这些催化剂可以将CO2还原成一氧化碳、甲醇、甲烷、甲酸、草酸等化工产品。例如，Guo等[24]报道的平面二配体铜复合物[Cu（qpy）]2+（qpy=2，2’：6’，2”：6”，2”’ -quaterpyridine）是可见光驱动CO2还原成CO的高效催化剂，该体系用[Ru（bpy）3]2+作为光敏剂，BIH/TEOA（1，3-dimethyl-2-phenyl-2，3-dihydro-1H-benzo [d]imidazole /triethano-lamine）作为牺牲电子供体，[Cu（qpy）]2+对含水乙腈溶液的可见光驱动CO2还原的催化活性TON和选择性分别为12 400和97%。Liu等[27]开发了铜（II）复合物（Et4N）[Cu（pyN2Me2）（HCO2）]，其作为催化剂在可见光照射下显示出高效的催化CO2还原活性，并有TON为9900和98%的高选择性。这些研究让人联想到生物化学中的金属酶。酶是天然生物催化剂，在温和的条件下加速催化反应[28]。受此启发，我们探索了含有4个铜结合位点的漆酶催化CO2还原的活性以及进化为CO2光还原酶的潜力。

基于以往铜复合物在可见光下可以固定CO2的报道，其铜原子的位点可以作为二氧化碳还原的催化位点，从而具有光催化转化二氧化碳的潜力。本文选取可以结合多个铜原子的CueO作为催化剂，[Ru（bpy）3]2+作光敏剂同时抗坏血酸钠作为牺牲还原剂。希望该体系能通过模拟天然光合作用系统吸收光能实现催化CO2还原的功能。这是首次尝试用CueO做催化剂还原CO2。通过该酶与光敏剂，牺牲还原剂形成复合体系，本文研究了一种新型的基于多铜酶为催化剂的光催化还原CO2的高效催化反应。

1 实验方法

1.1 试剂与仪器

硫酸铜（CuSO4）、氯化铜（CuCl2）、二硫代四乙基秋兰姆（TETD）、碳酸氢钠（NaHCO3）、抗坏血酸钠、钌（II）-二联吡啶金属配合物[Ru（bpy）3]2+、咪唑均为分析纯，购于北京市百灵威科技有限公司。CO2和Ar（纯度为99.999%）购于北京氦普北分气体工业有限公司。实验用水为Milli-Q双蒸水。

使用北京泊菲莱科技有限公司的PLS-SXE300D氙灯做为光源;使用宁波新芝生物科技有限公司的超声仪器进行细胞破碎;使用上海天能科技有限公司的蛋白电泳仪;使用上海尤尼柯仪器有限公司的紫外可见分光光度计（UV-visible spectroscopy）进行定性和定量分析; 使用美国Thermo公司的电感耦合等离子体-原子发射光谱（ICP-MS）对样品进行Cu的元素分析;使用美国SRI公司8610C气相色谱仪（GC）进行气体检测。

1.2 蛋白构建、表达和纯化

本文所描述的蛋白及突变体用pet28a载体构建。通过点突变，把CueO第500位的半胱氨酸残基突变为缬氨酸（CueOC500V）的引物设计为：（f） TGGCGCACGTTCATCTACTGGAGCATG;（r） CAGTAGATGAACGTGCGCCATATAAGC。

构建好质粒并测序成功后，在大肠杆菌细胞（E.coli BL21）中重组表达CueO。次日，挑取单克隆于100 mL含卡那霉素抗性LB培养基中，放到37 ℃摇床200 r/min过夜。然后，将菌液按1∶100接入含有卡那霉素抗性100 mL LB培养基中，放到37 ℃摇床200 r/min培养。当大肠杆菌生长到OD约为0.8时加入终浓度为1 mmol/L IPTG，分别于20 ℃和30 ℃诱导12 h。在4 ℃，4 000 r/min下离心30 min收菌。裂解缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.8，150 mmol/L NaCl）中的细胞通过超声裂解。超声后的细胞离心，将上清液上样到镍柱亲和层析柱（Ni-NTA柱）。用5 mL洗涤缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.8，150 mmol/L NaCl和10 mmol/L咪唑）洗涤Ni-NTA柱2次，然后用洗脱缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.8，150 mmol/L NaCl和250 mmol/L咪唑）洗脱目的蛋白。利用分子排阻层析（Superdex 75 10/300 GL; GE Healthcare）等方法进一步纯化蛋白。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测所需蛋白纯度和分子量，并用紫外可见吸收光谱对CueO进行定性和定量分析。为了提高CueO外源铜离子嵌入率，表达蛋白时额外添加1 mmol/L CuSO4或1 mmol/L CuCl2溶液以在CueO中引入更多铜离子。

1.3 CueO中铜含量的检测

本实验中利用电感耦合等离子体-原子发射光谱（ICP-MS）检测蛋白中铜的含量。将定量后的样品加入1.5 mL浓硝酸震荡混匀，然后在180 ℃的电热板上消解。溶液无明显反映现象后，冷却定容到10 mL即可上机测试。

实验使用四乙基秋兰姆-铜络合物显色的方法同样检测CueO中铜的含量[29]。首先，将0.4%二硫代四乙基秋兰姆（TETD）溶解于丙酮与水体积比为4∶1的溶液里待用。配制含有0，10 μmol/L，20 μmol/L，40 μmol/L和50 μmol/L CuSO4的溶液做为铜离子参照，然后用70%高氯酸进行消解。将上述样品在100 ℃水浴中恒温加热3 min，离心后分别加入50 μL的0.4% TETD进行显色反应。在3 h内，用分光光度计记录422 nm处读出吸光值。用紫外可见吸收光谱记录一系列不同铜离子浓度的吸光值并绘制标准曲线。每次定量CueO中铜离子含量都需要先绘制标准曲线。再用上述同样的方法对10 μmol/L CueO络合显色，并根据标准曲线计算得到蛋白中的铜含量。

1.4 光催化还原CO2活性實验

光催化系统的所有制备过程均在氩气保护的手套箱中进行。光催化反应选用500 μL的体系，包含0.1 mol/L NaHCO3、10 μmol/L催化剂CueO、1 mmol/L光敏剂[Ru（bpy）3]2+和0.1 mol/L牺牲还原剂抗坏血酸钠。然后密封于11 mL的玻璃容器，顶部空间用CO2吹扫。CueO在波长大于400 nm的氙灯照射下进行CO2还原的光催化实验。反应样品瓶距离氙灯光源15 cm并照射15 h。同时使用恒温水浴槽中控制光照反应温度为30 ℃。

采用气相色谱法对光催化后的顶空气体进行分析。根据标准气体的量进行定量实验得到CO的含量。光催化产生CO的量用TON表示，计算方法如式（1）所示。

式中：TON（turnover number）是转化数;[nCO]是CO的物质的量，mol;[ncatalyst]是催化剂的物质的量，mol。

2 结果与讨论

2.1 CueO的组成及表达纯化

CueO是有4个铜原子结合位点的金属酶[30]，该酶的PDB号是5B7E[31]。CueO周围的配位环境用软件PyMol进行解析，如图1所示。图1a）是3个铜原子结合位点，图1b）中含有1个单铜原子结合位点。由于CueO中的1个铜原子与2个组氨酸和1个半胱氨酸配位，因此在600 nm有特殊的紫外吸收峰。

通过SDS-PAGE检测得到的凝胶电泳图如图2所示，可发现在20 ℃和30 ℃ CueO均可表达。根据紫外可见光谱定量，结合蛋白的摩尔吸收消光系数[ε280nm=62 730]（mol/L）−1，计算得CueO表达量大约为40 mg/L。CueO分子量约为50 kD，与计算相符，说明CueO得到很好的表达并且纯度较高。

通过分子排阻层析法（Superdex 75）纯化的CueO如图3a）所示。收集单峰对应的蛋白进行SDS-PAGE鉴定。根据脱色完后得到的SDS-PAGE凝胶电泳图如图3b）所示，发现CueO纯度得到提高。

2.2 紫外可见吸收光谱对CueO的表征

利用紫外可見吸收光谱对CueO进行表征，如图4所示。实验发现CueO在600 nm附近有特征吸收峰，表明CueO中含有T1型铜离子。突变体CueOC500V在600 nm附近没有出现T1型铜离子特征吸收峰。通过用ICP-MS对等量的CueO和突变体CueOC500V进行Cu元素分析发现，CueOC500V中的铜离子嵌入率比CueO少38%。这进一步说明把结合1个铜原子的半胱氨酸残基突变后，此处就不能结合铜原子。

本实验中通过在培养体系中额外添加1 mmol/L CuSO4或CuCl2溶液提高CueO中铜的嵌入率，并通过四乙基秋兰姆-铜络合物显色的方法检测铜含量。通过标准曲线拟合得到线性相关方程y = 0.004 3x + 0.015 5（R = 0.990 2），以此计算CueO含铜量，如图5所示。实验发现，诱导过程中添加1 mmol/L CuSO4溶液最终纯化得到的CueO中铜离子嵌入率为57.5% [（nCueO∶nCu2+=10∶23）]，而添加1 mmol/L CuCl2溶液最终纯化得到的CueO铜离子嵌入率为67.5%[（nCueO∶nCu2+=10∶27）]。因此，发现额外添加含Cu2+溶液可以为CueO的4个铜结合位点提供外源铜离子，但其铜结合位点铜离子嵌入率依然不足。

2.3 光催化产生CO的活性检测

在包含0.1 mol/L NaHCO3、20 μmol/L催化剂CueO、1 mmol/L光敏剂[Ru（bpy）3]2+和0.1 mol/L牺牲还原剂抗坏血酸钠的光催化体系中，经过15 h的光照，生成1.94 μmol的CO，同时产物中有少量的H2。实验结果表明，在没有CueO的对照组中，没有检测到CO，检测到了少量的H2。其他对照组结果如表1所示，其中b～f组进一步表明在缺少[Ru（bpy）3]2+、抗坏血酸钠、CO2气体和光照等任何1个组分的情况下，检测不到任何的还原产物，这表明光催化CO2还原系统中需要以上所有组分。另外给光催化的体系通入氩气，GC没有检测到CO（表1中e），这表明CO的来源是CO2，而不是[Ru（bpy）3]2+或CueO的分解。

2.4 光诱导漆酶催化CO2还原反应条件的优化

2.4.1 体系pH值对CO产量的影响

实验选取pH=7、8、9的Tris-HCl缓冲液对光催化CO2还原进行反应，并用GC检测产生的CO含量，如图6所示。GC检测到在pH=7、8、9下CO含量分别为0.059%，0.262%，0.218%，经计算TON分别为25、115和100。根据实验结果发现在pH=8时结果比较理想。当pH小于或大于8时，该体系产CO的能力都会降低。这可能是由于当pH小于8时，体系中抗坏血酸钠会质子化，给电子能力降低，而pH大于8时，由于溶液中游离的H+减少，会降低体系活性。综上所述，反应的pH=8用于后续光照实验。

2.4.2 体系光敏剂[Ru（bpy）3]2+浓度对产CO活性的影响

光吸收效率在很大程度上取决于人工光合系统的光敏剂。因为光促进光敏剂的电子进入高能级的导带，而激发空出的空穴被牺牲还原剂氧化而填充。导带上的电子会继续转移到酶的活性位点，进而促进CO2催化还原。本实验采用含金属钌的[Ru（bpy）3]2+做为光敏剂，研究了光敏剂浓度对CueO催化活性的影响。分别测试200 μmol/L、300 μmol/L、500 μmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L浓度的[Ru（bpy）3]2+对光照活性的影响，结果如图7所示。实验结果表明不同浓度的光敏剂对CO2催化还原起着重要作用。随着光敏剂浓度的增加，单位时间内吸收的光子数增加，有利于将电荷转移到酶的活性位点上，催化产生的CO增加。

2.4.3 CueO浓度对产CO的影响

在光催化体系下，以20 μmol/L、40 μmol/L和60 μmol/L的CueO作为催化剂，产生的CO活性如图8所示。不同浓度的CueO对光催化有不同的活性。根据3次平行实验发现随催化剂CueO的浓度的增加，光驱动还原反应产生CO的量也随之增加。这种现象是随着CueO的浓度增加，会有更多的底物作用到酶的活性位点，催化产生CO的量也随之增加。

2.4.4 不同光照时长对产CO活性的影响

对该体系进行3 h、6 h、12 h、15 h的光照实验。实验结果如图9所示。图中光催化产CO的活性随着光照时间增加逐渐增加。当光照3 h、6 h、12 h、15 h，60 μmol/L的CueO分别产生0.40 μmol、0.59 μmol、0.97 μmol、1.94 μmol的CO。光照相同时间，CueO的浓度越高产生的CO量越多。

2.5 CueO突变对还原CO2的影响

在光催化体系下，对相同浓度的CueO和突变体CueOC500V进行光照15 h的光催化实验。实验结果如表2所示。CueO和突变体CueOC500V都会对光催化CO2还原产生活性，并且用突变体CueOC500V催化还原CO2的TON比CueO高33。因此，实验分析CueO催化还原CO2活性位点发生在其三铜中心。

2.6 透射电镜对CueO的表征

对于光催化反应，纳米颗粒会促进体系催化反应的发生，那么起到催化作用可能就不是生物酶。为了验证在催化过程中起催化作用的不是由于光照后形成的纳米铜，对光照前后的样品进行了透射电镜（TEM）测试，结果如图10所示。图10 a）是光照前的样品。在光照前，图中并没有形状规整的颗粒存在。图10 b）是光照后的样品，并没有类似颗粒物存在。由测试图前后对照发现样品在经过光照后没有形成纳米颗粒。所以，CueO在光诱导催化CO2还原的过程中起着催化的作用。

3 结论

本文通过光合作用原理探索了可见光驱动CueO还原CO2为CO。通过比较20 ℃和30 ℃诱导表達蛋白的情况，结果发现蛋白在这2个温度下都会得到表达，温度对其表达影响不大。进一步用分子排阻层析法纯化，得到较纯的CueO。通过外源加入1 mmol/L CuSO4溶液，使CueO的铜嵌入率达到57.5%以上。在可见光照射15 h后伴有192的TON值。对照实验表明在缺少[Ru（bpy）3]2+、抗坏血酸钠、CO2气体和光照等任何一个条件，不会检测到任何的还原产物，这表明光催化CO2还原系统中需要以上所有组分。随着光敏剂浓度的增加，催化产生的CO增加。光催化产CO的活性随着光照时间增加逐渐增加。通过对CueO进行点突变，发现CueO催化还原CO2活性的催化发生在其三铜中心。可见光驱动漆酶还原CO2为CO的机理还需进一步实验研究。可见光驱动酶系统的发展对生产低碳燃料和缓解能源短缺具有重要意义。利用光合作用和生物酶催化相结合，太阳光为绿色化学提供了一个更环保的机会。这对酶催化CO2还原提供了新的思路。

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