表面定向磁性印迹聚合物的制备及对槲皮素的选择性识别

李 菲，李小轩，李一峻，何锡文，陈朗星，张玉奎，3

（1.山东师范大学化学化工与材料科学学院,济南250000；2.南开大学化学学院,生物传感与分子识别天津市重点实验室,天津300071；3.中国科学院大连化学物理研究所,大连116023）

黄酮类化合物具有独特的抗氧化、抗炎等作用，是古代成功入药的重要化合物之一［1，2］.黄酮类化合物种类繁多，截至2009年底，已鉴定出4000多种黄酮类化合物.不同的黄酮类化合物由于官能团的不同而具有不同的药理作用，这意味着提高其分离纯度将有助于提高对相关疾病的治疗效果.槲皮素（Que）是一种多酚化合物，含有顺式二醇结构，属于黄酮醇［3，4］.它存在于各种食物中，包括蔬菜和水果，如茶、可可粉、蔓越莓、甘蓝、芹菜、花椰菜、生菜、西红柿和胡萝卜等［5，6］.Que可清除自由基和结合过渡金属离子的能力使其能够抑制减少氧化应激和相关的损伤，还具有抗氧化、抗病毒和抗肿瘤等多种生物活性［7，8］.另外，Que还显示出治疗和预防各种疾病的潜力，如癌症、骨质疏松症、哮喘、阿尔茨海默病、糖尿病和皮肤病等.目前Que的提取和测定已有多种不同的分析方法，最常用的有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱-质谱（GC-MS）法、紫外-可见（UV-Vis）分光光度法、毛细管电泳（CE）法和电分析方法等［9］.然而，Que通常存在于复杂的体系中，且黄酮类化合物在结构上有一定的相似性，要达到所需的纯度很困难.因此，建立一种高选择性、简便、准确的Que含量测定方法具有重要意义.

分子印迹聚合物（MIPs）是一种化学合成的受体，具有预先设计的结合位点和对靶分子的刚性.分子印迹过程通常涉及在模板（靶）的存在下引发功能单体与交联剂的聚合，从而在聚合物基质中留下具有特异性的互补空腔［10，11］.与抗体等生物分子相比，MIPs具有制备简单、成本低及稳定性好等优点.MIPs在许多领域都有重要的应用，如化学传感、分离、催化和疾病诊断等［12］.硼酸是在共价印迹中能够可逆结合核苷、糖、多糖和糖蛋白等含顺式二醇化合物的重要功能单体［13］.近年来，硼酸功能化材料受到越来越多的关注.然而，传统的硼酸亲和材料有一些明显的缺点：（1）普通硼酸需要在碱性条件才能最终结合，而在较低pH值的条件下结合需要特殊合成的硼酸或材料；（2）硼酸本身具有广谱选择性，因此非目标顺式二醇分子可能严重干扰其与含有顺式二醇的目标的结合；（3）结合强度低［14］.考虑到选择性和灵敏度对检测方法效率的重要性，将硼酸亲和力的共价结合作用与分子印迹技术相结合，提出了一种新的印迹策略，称为硼酸亲和表面定向印迹，用于制备高性能的分子印迹材料.这种定向印迹策略是基于官能化的固体基质和模板之间的相互作用，主要有以下优点：（1）不溶于聚合溶剂的模板可以先固定在官能化的固体基质上，然后再与单体接触；（2）需要的模板较少；（3）定向固定化可以提供有序排列的模板，从而能够产生均一的结合位点［15］.考虑到硼酸配体与顺式二醇分子之间的可逆相互作用，硼酸配体在模板固定和去除方面表现出独特的优势.更具体地说，在模板固定化过程中，共价相互作用（硼酸亲和力）比非共价相互作用更稳定，印迹过程可以产生更均匀的结合位点分布.此外，硼酸配体与顺式二醇分子之间的相互作用很容易被酸性溶液破坏，这有利于模板的去除.因此，与表面印迹技术相结合，硼酸亲和力导向的表面印迹几乎可以完全去除模板分子，并为目标分子提供更易接近的结合位点［16］.

本文通过一种简便、绿色的硼酸亲和表面定向印迹法制备了Que磁性分子印迹聚合物，用于选择性检测银杏叶中的Que.印迹策略如Scheme 1所示.首先，通过硼酸亲和作用将Que（模板分子）固定在硼酸功能化磁性碳纳米管（DFFPBA-MCNTs）上［17，18］.然后，通过采取双功能单体（DA+APBA）在水溶液中自聚形成的具有适当厚度的聚合物薄层来覆盖Que.最后，加入酸性溶液以破坏硼酸的亲和作用，去除模板分子.所得印迹材料具有选择性好、抗干扰能力强及结合平衡快等特点.同时，通过对银杏叶提取物样品中微量Que的选择性分析，证明了该材料在实际应用中的可行性.

Scheme 1 Synthetic route of Que-MIPs@MCNTs nanomaterials

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

Que购自上海麦克林生化科技有限公司；黄岑素（Bai）、木犀草素（Lut）、杨梅素（Myr）、2，4-二氟-3-甲酰基苯硼酸（DFFPBA）和氰基硼氢化钠（NaBH3CN）购自北京百灵威科技有限公司；间氨基苯硼酸（APBA）、多巴胺（DA）、过硫酸铵（APS）、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；芹菜素（Api）购自上海迈瑞尔化学技术有限公司；磷酸购自天津康科德科技有限公司；多壁碳纳米管购自深圳纳米港有限公司；银杏树叶取自南开大学校园树林.

TecnaiG2 T2 S-TWIN型透射电子显微镜（TEM，荷兰飞利浦公司）；ESCALAB 250Xi型X射线光电子能谱仪［XPS，赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；Rigaku D/Max-2500X型X射线衍射仪（XRD，日本理学电机公司）；LDJ 9600-1型振动样品磁强计（VSM，美国LDJ Electronics公司）；LC-20AT型高效液相色谱仪（HPLC，日本岛津公司）.

1.2 硼酸功能化磁性碳纳米管(DFFPBA@APTES@TEOS@MCNTs)的制备

DFFPBA@APTES@TEOS@MCNTs的合成分为4个步骤.（1）MCNTS的合成：参照文献［19］方法合成MCNTs.（2）TEOS@MCNTs的合成：通过超声将200.0 mg MCNTs均匀分散到50.0 mL乙醇/水混合溶液（体积比4∶1）中，加入3 mL氨水，继续超声5 min后，逐滴加入300.0µL TEOS（分散在10.0 mL乙醇中），室温下搅拌反应12 h，用磁铁分离黑色固体，并将其用超纯水、无水乙醇洗涤多次，真空干燥，待用.（3）APTES@TEOS@MCNTs的合成：将150.0 mg TEOS@MCNTs均匀分散于120.0 mL异丙醇中，快速加入1.00 mL APTES，室温下反应12 h后用磁铁分离黑色固体，并将其用超纯水、无水乙醇洗涤多次，真空干燥，待用.（4）DFFPBA@APTES@TEOS@MCNTs的合成：将100.0 mg APTES@TEOS@MCNTs分散于20.0 mL无水甲醇中，随即加入200.0 mg DFFPBA和200.0 mg NaBH3CN，室温下反应24 h后用磁铁分离黑色产物，并将其用超纯水、无水乙醇洗涤多次，真空干燥，待用.

1.3 表面定向磁性分子印迹（Que-MIPs@MCNTs）和非印迹（NIPs@MCNTs）聚合物的制备

参照文献［13］方法制备Que-MIPs@MCNTs.将1.00 mg Que和20.0 mg DFFPBA@APTES@TEOS@MCNTs超声分散于10.0 mL新配制的PBS缓冲溶液（pH=8.5，10.0 mmol/L）中，室温下搅拌2 h后，经磁分离并用PBS缓冲溶液洗涤产物3次.随后，向10.0 mL含有APBA（8.00 mg），DA（10.0 mg）和APS（6.00 mg）的PBS缓冲溶液（pH=8.5，10.0 mmol/L）中加入上述产物，超声分散均匀，继续反应0.5 h.反应结束后，用磁铁分离所得磁性印迹聚合物，并用甲醇/乙酸混合溶液（体积比99：1）洗涤数次以去除模板分子Que.最后，用超纯水和乙醇多次洗涤所得Que-MIPs@MCNTs，并于50℃真空干燥，待用.

非印迹聚合物（NIPs@MCNTs）的制备过程除不加模板分子Que外与印迹聚合物制备过程一致.

1.4 聚合物吸附性能的考察

1.4.1 动力学吸附实验将2.00 mg Que-MIPs@MCNTs或NIPs@MCNTs分别置于2.00 mL浓度为60.0µg/mLQue的乙醇溶液中，超声分散均匀后分别振荡0~30 min.随后用磁铁将MIPs或NIPs与上层清液分离，并用HPLC法测定上层清液中Que的浓度.

1.4.2 热力学吸附实验将2.00 mg Que-MIPs@MCNTs或NIPs@MCNTs分别置于2.00 mL浓度为0~120.0µg/mL Que的乙醇溶液中，超声分散均匀后于室温下振荡20 min.随后用磁铁将MIPs或NIPs与上层清液分离，并用HPLC法测定上层清液中Que的浓度.

1.4.3 选择性吸附实验选择杨梅素、木犀草素、芹菜素和黄岑素为Que的结构类似物进行选择性吸附实验.将2.00 mg Que-MIPs@MCNTs或NIPs@MCNTs分别置于2.00 mL 60.0µg/mL Que和结构类似物的混合乙醇溶液中，超声分散均匀后于室温下振荡20 min.随后用磁铁将MIPs或NIPs与上层清液分离，并用HPLC法测定上层清液中Que及其结构类似物的浓度.

1.4.4 重复性实验将2.00 mg聚合物置于2.00 mL 60.0µg/mL Que的乙醇溶液中，超声分散均匀后于室温下振荡20 min.用磁铁将磁性聚合物与上层清液分离，并用甲醇/乙酸混合溶液（体积比99∶1）洗涤数次除去模板分子Que.最后，用超纯水和乙醇多次洗涤所得Que-MIPs@MCNTs或NIPs@MCNTs，并于50.0℃真空干燥，待用.使用同一批的Que-MIPs@MCNTs或NIPs@MCNTs进行了6次吸附-解吸循环实验.

Que-MIPs@MCNTs或NIPs@MCNTs对Que及其结构类似物吸附量的计算公式如下：

式中：Q（µg/mg）表示Que-MIPs@MCNTs或NIPs@MCNTs的吸附容量；c0（µg/mL）为Que或结构类似物的初始浓度；cs（µg/mL）为Que或结构类似物的平衡浓度；V（mL）为吸附溶液的总体积；m（mg）为在吸附过程中加入的Que-MIPs@MCNTs或NIPs@MCNTs的质量.

1.5 聚合物在中药实际样品中的应用

参照文献［20］方法，将银杏叶用清水洗净，加入烧杯中置于烘箱中干燥后，粉碎，称取1.000 g，按照液固比15∶1加入70%乙醇溶液，超声溶解30 min.将样品用0.22µm尼龙膜过滤后，进行HPLC检测.HPLC检测条件：流动相V（甲醇）∶V（水）=6∶4（0.40%H3PO4），流速为0.80 mL/min，检测波长为373 nm.

2 结果与讨论

2.1 Que-MIPs@MCNTs的表征

通过透射电子显微镜（TEM）表征了MCNTs和Que-MIPs@MCNTs纳米材料的形貌.图1（B）为Que-MIPs@MCNTs的TEM照片，与图1（A）相比，其薄膜层厚度增加约58 nm，表明印迹聚合物层已包覆在纳米材料内表面，其厚度适中，有利于后续吸附-再生循环实验.

Fig.1 TEM images of MCNTs(A)and Que-MIPs@MCNTs(B)nanomaterials

通过X射线光电子能谱（XPS）表征了DFFPBA@MCNTs和Que-MIPs@MCNTs纳米材料的化学组成和表面结构.如图2所示，DFFPBA@MCNTs和Que-MIPs@MCNTs在B1s（187 ev），C1s（285 eV），N1s（399.7 eV），O1s（533 eV），F1s（688 eV）和Fe2p（710 eV）谱线上均能观察到对应元素的特征峰，表明各步修饰已完成.另外，由表1可看出，与DFFPBA@MCNTs相比，Que-MIPs@MCNTs中B元素和N元素含量有所增加，而F元素含量几乎保持不变.

Fig.2 XPS spectra of B(A),F(B),DFFPBA@MCNTs(a)and Que-MIPs@MCNTs(b)nanomaterials(C)

Table 1 XPS data of DFFPBA@MCNTs and Que-MIPs@MCNTs nanomaterials

通过X射线衍射（XRD）表征了CNTs，MCNTs和Que-MIPs@MCNTs纳米材料的晶型结构.如图3所示，2θ=26.32°处的强衍射峰是碳纳米管的经典衍射峰，2θ=30.08°，35.34°，43.04°，53.34°，56.98°和62.54°处出现的新峰分别对应于Fe3O4纳米粒子的（220），（311），（400），（422），（511）和（440）晶面（JCPDS No.19-629）.此外，图3谱线c上衍射峰的强度比谱线b上的峰强度明显下降，说明在MCNTs表面包覆了非磁性聚合物.

通过振动样品磁强计（VSM）了MCNTs和Que-MIPs@MCNTs纳米材料的磁性能.如图4所示，制备的磁性纳米材料没有磁滞现象，具有超顺磁性，可以满足测试过程中快速分离的需求.此外，Que-MIPs@MCNTs的饱和磁强度（1.95×105A/m）比MCNTs（2.20×105A/m）稍低，说明在MCNTs表面包覆了非磁性聚合物.

Fig.3 XRD patterns of CNTs(a),MCNTs(b)and Que-MIPs@MCNTs(c)nanomaterials

Fig.4 VSM curves of MCNTs(a)and Que-MIPs@MCNTs(b)nanomaterials

2.2 印迹条件的优化

为了取得最优的印迹效果，对印迹聚合物的制备条件进行了优化.

2.2.1 功能单体的选择APBA和DA可分别用作分子印迹过程中的功能单体，但它们不能很好地用于含顺式二醇结构分子的基于硼酸的表面定向印迹［图5（A）］.与模板分子相比，DA与硼酸的结合亲和力更强，因此如果单独使用DA，它将与模板分子发生竞争关系并有可能取代模板分子，从而导致印迹不会以定向印迹的方式发生；而如果单独使用APBA，生成的聚合物可能含有一些残留的硼酸部分，从而在印迹腔外存在非印迹结合位点，这也是不利于定向印迹的.APBA和DA的共聚过程可能是由于APBA的顺式二醇基团与DA之间的脱水反应，因此为了消除APBA和DA共聚产生聚合物中残留的硼酸基团，将APBA与DA的摩尔比设定为1∶1［21］.

Fig.5 Optimization of imprinting conditions

2.2.2模板分子用量及模板定向化时间的选择模板的固定化在表面定向印迹过程中起着至关重要的作用.如果模板分子在印迹前未被固定或者有过多的模板分子游离在印迹溶液中，则得到的印迹聚合物可能会有较高的非特异性.通过对模板分子用量［图5（B）］及定向化时间［图5（C）］进行优化，选择模板分子用量为1.00 mg，定向化时间为4 h.

2.2.3 APBA和DA预聚合时间的选择APBA的溶解相对较慢，因此在印迹前先将APBA置于PBS缓冲溶液中用超声辅助溶解，直至形成透明溶液.然后，向其中加入DA，超声辅助溶解，直至溶液再次透明.通过改变两者共聚的时间，发现共聚30 min时可得到最优的印迹效果［图5（D）］.

2.2.4 印迹时间的选择通过将APBA和DA在水中共聚合形成的亲水性涂层沉积到硼酸功能化的MCNTs表面，形成了具有一定厚度的印迹层.印迹层的厚度可通过调整印迹时间来调整［图5（E）］，这也有利于结合位点的均匀分布.实验发现印迹时间为30.0 min时效果最佳.

2.3 Que-MIPs@MCNTs的吸附性能

通过固定Que标准溶液浓度，仅改变制备的纳米材料与Que标准溶液的接触时间（0~30 min），研究了Que-MIPs@MCNTs和NIPs@MCNTs对Que的吸附动力学行为.图6（A）结果表明，由于Que-MIPs@MCNTs表面丰富的印迹位点和初始较高的Que浓度，在前15 min内吸附量持续增加，随着结合位点不断被模板分子占据，吸附量在约20 min时减慢并达到平衡.虽然NIPs@MCNTs对Que的吸附趋势与印迹聚合物类似，但Que-MIPs@MCNTs的吸附量远高于非印迹聚合物.这主要是由于NIPs@MCNTs表面缺少特异性的结合位点，其吸附仅归因于非特异性结合能力，导致结合亲和力较低.根据动力学吸附曲线图得出最佳吸附时间为20 min.为了进一步研究所制备的印迹材料的吸附性能，进行了一系列不同初始浓度下Que标准溶液（0~120.0µg/mL）的等温吸附平衡实验.图6（B）显示了依赖于Que初始浓度的Que-MIPs@MCNTs和NIPs@MCNTs的平衡吸附量.结果表明，当Que标准溶液浓度在60.0µg/mL以下，随着初始浓度的增加，Que在Que-MIPs@MCNTs和NIPs@MCNTs上的吸附容量逐渐增大.当浓度高于60.0 µg/mL时，吸附量趋于稳定并饱和.在整个浓度范围内，由于结合作用的不同，Que-MIPs@MCNTs的吸附量远大于NIPs@MCNTs.在实际检测中，吸附环境中的干扰因素往往会影响分子印迹聚合物的识别结果.因此，有必要考察分子印迹聚合物在识别过程中的选择性和特异性.通过选择性吸附实验研究了Que-MIPs@MCNTs对Que的选择性.选择杨梅素、木犀草素、芹菜素和黄岑素作为结构竞争者［图6（D）］.Que-MIPs@MCNTs的特异性吸附性能通过Que在聚合物和溶液之间的分配系数（K）、印迹因子（IF）和选择性系数（SC）来评价.计算公式如下：

Fig.6 Adsorption kinetics(A),isotherms(B),selectivity(C)of Que-MIPs@MCNTs and NIPs@MCNTs towards Que and the molecular structures of Que and the analogues(D)

式中：cp是与MIPs或NIPs结合的Que的浓度；cs是吸附平衡时残留在溶液中的Que的浓度；Ki和Kc分别代表MIPs和NIPs的分配系数；IFQue和IFi是Que和其它4种结构类似物的印迹因子.

如表2和图6（C）所示，与相同初始浓度的结构类似物相比，Que-MIPs@MCNTs对Que具有更好的结合能力，而NIPs@MCNTs对Que的结合能力与其它几种物质相差不大.这些结果表明，Que-MIPs@MCNTs上的印迹位点对Que具有特异的识别能力且占吸附的主导地位.

Table 2 Partition coefficients(K),imprinting factor(IF),and selectivity coefficient(SC)to Que and the analogues(Myr,Lut,Api,Bai)of Que-MIPs@MCNTs and NIPs@MCNTs

印迹聚合物的一个显著特点是具有良好的机械稳定性和可重复使用性.因此，研究制备的印迹材料的再生能力具有重要意义.使用甲醇/乙酸混合溶液（体积比99∶1）作为洗脱液，进行了6次吸附-再生循环吸附实验.如图7所示，Que-MIPs@MCNTs对Que的吸附量在第一次循环后无明显损失，6次循环后损失了约14%.随着洗脱次数的增加，吸附量的降低可归因于洗脱时印迹聚合物表面特异性结合位点的破坏以及多次的酸洗脱可能会使聚合物表面的APBA+DA共聚层脱落（因此洗脱时酸浓度要低）.但是总体来说，所制备的印迹聚合物材料具有良好的再生能力，并能很好地保持其吸附能力，可重复使用，具有较好的物理稳定性、机械耐久性和可逆性.这些优良的性能使其有可能应用于实际样品的检测或预处理过程.

Fig.7 Reusability of Que-MIPs@MCNTs and NIPs@MCNTs

2.4 方法验证及Que-MIPs@MCNTs在实际样品中的应用

通过对检测限（LOD）、定量限（LOQ）和线性范围等参数的评价，验证了该方法的可行性.结果表明，Que在0.050~200.0 µg/mL浓度范围内线性关系较好，其线性相关性系数为0.9998，线性方程为y=77643x+12402.该方法的LOD和LOQ值分别为8.50和25.0 ng/mL.

Fig.8 Chromatograms of direct analysis of Ginkgo biloba sample(a),the spiked Ginkgo biloba sample(b)and the sample after adsorption by Que-MIPs@MCNTs(c)

将Que-MIPs@MCNTs应用于银杏叶提取物中Que的选择性吸附.将20.0 mg Que-MIPs@MCNTs分散到1.00 mL银杏叶提取液中，用V（甲醇）/V（乙酸）=99∶1的混合溶液洗涤吸附剂，相应的色谱图如图8所示.未加标银杏叶提取液的色谱图可以看到多个色谱峰（谱线a）.为了确定Que的峰位置，向等量该提取液中加入Que标准溶液，可发现Que的特征峰位于10.357 min处（谱线b）.未加标银杏叶提取液经Que-MIPs@MCNTs吸附后，Que的特征峰几乎完全消失了，而其它位置的峰仍然存在并几乎保持不变（谱线c）.由此可知，所制备的Que-MIPs@MCNTs能够选择性、高效地吸附银杏叶提取液中的Que.

3 结 论

采用硼酸功能化的MCNTs作为反应基质，通过表面定向印迹法设计并制备了新型槲皮素印迹聚合物，并将其应用于银杏叶提取物中槲皮素的特异性识别.TEM，XPS，XRD及VSM测试结果表明，制备的分子印迹聚合物具有良好的形貌和晶型结构等.吸附实验结果表明，该分子印迹聚合物对模板分子槲皮素具有较理想的吸附容量（4.57µg/mg）、高的选择性（IF=8.44）和较好的再生能力.对实际样品银杏叶提取物的吸附实验表明，所建立的方法能达到预期的槲皮素吸附检测效果，可作为槲皮素特异性识别的有效工具.