咪唑配位的半三明治钌金属(Ⅱ)大环化合物的合成及抗癌活性

段 军，周萍萍，张立倩，马 琳，喻 文，朱美琦，庄敏艳，杨凤磊，曹昌盛，张 鹏，史延慧

（1.江苏师范大学化学与材料科学学院,2.生命科学学院,徐州221116）

铂（Pt）金属类抗癌药物是主要的化疗药物之一，广泛应用于50%以上的各类癌症的治疗，对睾丸癌、膀胱癌及卵巢癌等有良好的治疗效果［1］.但这类抗癌药物也存在一些局限性，如水溶性差、有多种毒副作用以及抗癌谱狭窄等［2~4］.为了解决铂类抗癌药物所存在的问题，在过去的几十年中，研究人员不断努力开发不同结构和不同类型的过渡金属抗癌化合物，其中钌（Ru）基金属抗癌化合物是最有前途的抗癌化合物之一［5~7］.比较有代表性的是Ru（Ⅲ）基金属抗癌化合物NAMI-A［8］，在1999年进入临床I期实验，2003年进入临床II期实验.与铂类抗癌化合物相比，钌金属抗癌化合物具有良好的抗癌活性、低的健康组织毒性及抗转移特性，极有潜力成为铂类化合物抗癌药物的替代物［8~10］.研究发现，钌基化合物主要起抗癌作用的是二价Ru，这可能是由于肿瘤组织为还原环境，可使三价Ru还原成二价［11］.由于肿瘤组织通透性增加，导致癌细胞更容易摄入大分子，且癌组织受损的淋巴通道致使大分子化合物不容易排出，滞留在肿瘤细胞内，这就是大分子的EPR效应（Enhanced permeability and retention effect），因此大分子的药物具有潜在的应用价值［12，13］.

通过配位驱动的自组装策略可以将Ru（II）接受体与特定角度的配体组装，从而构建不同构型的环状或笼状超分子化合物［14，15］.金属大环化合物在分子识别［16~18］、分离材料［19~21］、催化反应［22~24］、主客体化学［25~27］和生物学［28~30］等领域备受关注.前文［31］报道了以［Ru2（donq）（η6-p-cymene）2］（O3SCF3）2（donq=5，8-dioxido-1，4-naphtoquinonato）与1，4-双咪唑基苯和1，3-双咪唑基苯组装得到的四核矩形金属大环，与1，3，5-三咪唑基苯组装得到的六核三棱柱金属笼子，并对其体外抗癌活性进行了评估，这些组装体均表现出较好的抗癌活性.此外，较大结构的笼状化合物比较小的矩形表现出更高的活性.鉴于这些组装体分子表现出类大分子的EPR效应，为了增加组装体的分子量和改善组装体的溶解度，本文合成了带有不同长度烷氧基的1，3-双咪唑苯基配体（1~3）及相应的组装体.配体通过配位自组装的方式与半三明治钌（Ⅱ）（Ru1~Ru3）组装得到了组装体4~12，测定了这些组装体对人癌细胞系的体外抗癌活性，并对抗癌机理进行了探究.以斑马鱼卵以及斑马鱼的体内肿瘤为生物模型，初步探究了组装体的生物毒性和体内抗肿瘤活性.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

氯化钠、碳酸钾、无水硫酸钠、三乙胺、甲醇、乙醚、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯和二甲基甲酰胺，国药集团化学试剂有限公司；3，5-二溴苯酚、碘甲烷、咪唑、对甲基苯磺酰氯、二乙二醇甲醚、二缩三乙二醇、草酸铵、三氟甲磺酸银、乙酸钠和二氯双（4-甲基异丙基苯基）钌（Ⅱ），上海安耐吉化学试剂公司；1，4-二羟基苯醌和5，8-二羟基-1，4-萘醌，日本东京化成工业株式会社；小牛胸腺DNA（CT-DNA）和溴化乙锭，北京百灵威科技有限公司；胰蛋白酶和胎牛血清，上海玉博生物科技有限公司；A549（人肺癌细胞）、MDA-MB-231（人乳腺癌细胞）、HepG-2（人肝癌细胞）和MCF-7（人乳腺癌细胞），赛百康（上海）生物技术股份有限公司；HBE（人支气管上皮细胞）和THLE-2（人肝细胞），武汉普诺赛生命科技有限公司；野生AB型斑马鱼，南京-树梨花生物科技有限公司；所用试剂均为分析纯.

AVANCEⅢ400 MHz型核磁共振波谱仪（NMR）和MicroToF-QⅡ型电Ⅱ喷雾飞行时间质谱仪，德国布鲁克公司；vario MACRO cube CHNS型微量元素分析仪，德国元素分析系统公司；F-4600型荧光分光光度计，日本日立公司；OPTIMA 3300DV型ICP电感耦合等离子体光谱仪（ICP-MS）和LAMBDA 365型紫外-可见分光光度计（UV-Vis），美国铂金埃尔默有限公司；Synergy H4 Hybrid Re型酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；BM-37XCC型倒置生物显微镜，上海彼爱姆光学仪器制造有限公司.

1.2 组装体的合成

1.2.1 组装体4~12合成的通用方法参照文献［32~34］方法制备半三明治钌（Ⅱ）（Ru1~Ru3）和配体1~3.将配体1~3分别与相应的半三明治钌（Ⅱ）Ru1~Ru3以摩尔比1∶1加入到8 mL催化瓶中；再加入6 mL甲醇/二氯甲烷（体积比为1∶1混合溶液），室温下反应24 h后，将溶剂浓缩至0.5 mL以下，加入6 mL乙醚后析出沉淀，离心得到固体样品，将固体真空减压干燥，得到组装体4~12（Scheme 1）.

Scheme 1 Synthetic routes for assemblies of 4—12

1.2.2 组装体4的合成及表征Ru1（4 μmol，3.4269 mg）与配体1（4 μmol，0.9610 mg）反应得到组装体4，黄色固体粉末，产率为81%.1H NMR（400 MHz，CD3OD），δ：8.34（s，2H），7.75（s，2H），7.05~6.97（m，6H），6.60（s，8H），5.96（d，J=6.2 Hz，8H），5.80（d，J=6.2 Hz，8H），3.94（s，6H），2.82（p，J=6.9 Hz，4H），2.23（s，12H），1.34（d，J=6.9 Hz，24H）；13C NMR（100 MHz，CD3OD），δ：172.4，163.3，139.1，138.6，130.6，121.2，106.3，104.2，102.7，99.3，83.7，81.8，56.8，32.4，22.5，18.2；元素分析实验值（%，C74H80O22N8S4F12Ru4理论值）：C 40.51（40.65），H 3.68（3.45），N 5.11（5.06）.

1.2.3组装体5的合成及表征Ru1（4 μmol，3.4269 mg）与配体2（4 μmol，1.3134 mg）反应得到组装体5，黄色固体粉末，产率为75%.1H NMR（400 MHz，CD3OD），δ：8.33（t，J=1.4 Hz，4H），7.75（t，J=1.6 Hz，4H），7.01（s，6H），6.59（t，J=1.4 Hz，4H），5.96（d，J=6.1 Hz，8H），5.80（d，J=6.1 Hz，8H），4.27~4.24（m，4H），3.95~3.88（m，4H），3.76~3.71（m，4H），3.63~3.57（m，4H），2.82（p，J=6.9 Hz，4H），2.23（s，12H），1.34（d，J=6.9 Hz，24H）；13C NMR（100 MHz，CD3OD），δ：172.4，162.7，139.2，138.6，130.7，121.3，107.1，104.4，102.6，99.4，83.8，81.8，73.0，71.6，70.7，69.9，59.1，32.5，22.8，18.2.元素分析实验值（%，C78H96O26N8S4F12Ru4理论值）：C 40.34（41.57），H 4.17（3.78），N 4.83（4.71）.

1.2.4 组装体6的合成及表征Ru1（4 μmol，3.4269 mg）与配体3（4 μmol，1.4897 mg）反应得到组装体6，黄色固体粉末，产率为70%.1H NMR（400 MHz，CD3OD），δ：8.34（s，4H），7.75（s，4H），7.02（s，6H），6.59（s，4H），5.96（d，J=6.3 Hz，8H），5.80（d，J=6.3 Hz，8H），4.31~4.23（m，4H），3.95~3.90（m，4H），3.77~3.75（m，4H），3.71~3.69（m，4H），3.67~3.65（m，0H），3.34（s，6H），2.85~2.79（m，4H），2.23（s，12H），1.34（d，J=7.0 Hz，24H）；13C NMR（100 MHz，CD3OD），δ：172.4，162.7，139.1，138.5，130.6，121.2，107.2，104.3，102.6，99.3，83.8，81.7，72.9，71.7，71.5，71.3，70.6，69.9，59.1，32.4，22.6，18.2；ESI-MS实验值（［M−2OTf］2+理论值），m/z：1081.14398（1081.13924）；元素分析实验值（%，C86H104O28N8S4F12Ru4理论值）：C 42.02（39.85），H 4.26（3.72），N 4.56（4.41）.

1.2.5 组装体7的合成及表征Ru2（4 μmol，3.6271 mg）与配体1（4 μmol，0.9610 mg）反应得到组装体7，红色固体粉末，产率为76%.1H NMR（400 MHz，CD3CN），δ：8.06（d，J=2.1 Hz，4H），7.53（d，J=1.7 Hz，4H），7.03（t，J=1.9 Hz，2H），6.80（d，J=1.8 Hz，4H），6.76（s，4H），5.91（d，J=6.0 Hz，8H），5.76（s，4H），5.73（d，J=6.0 Hz，8H），3.84（s，6H），2.80（p，J=6.9 Hz，4H），2.18（s，12H），1.29（d，J=6.9 Hz，24H）；13C NMR（100 MHz，CD3CN），δ：184.0，161.4，138.2，137.4，130.1，120.1，106.4，105.2，102.5，101.4，99.1，83.6，80.9，56.2，31.1，21.5，17.5；元素分析实验值（%，C82H96O22N8S4F12Ru4理论值）：C 42.71（40.77），H 4.20（3.34），N 4.86（4.68）.

1.2.6 组装体8的合成及表征Ru2（4 μmol，3.6271 mg）与配体2（4 μmol，1.3134 mg）反应得到组装体8，红色固体粉末，产率为70%.1H NMR（400 MHz，CD3CN），δ：7.94（d，J=1.9 Hz，4H），7.58~7.53（m，4H），7.10（d，J=2.0 Hz，2H），6.76（d，J=1.6 Hz，4H），6.54（d，J=1.8 Hz，4H），5.92（d，J=6.1 Hz，8H），5.82（s，4H），5.74（d，J=6.1 Hz，8H），4.03~3.98（m，4H），3.90（dd，J=5.5，2.6 Hz，4H），3.80~3.74（m，4H），3.59~3.53（m，4H），3.24（s，6H），2.83~2.74（m，4H），2.19（s，12H），1.27（d，J=6.9 Hz，24H）；13C NMR（100 MHz，CD3CN），δ：183.9，160.0，138.2，137.2，130.1，120.3，107.2，106.0，102.1，101.4，99.2，83.8，80.7，71.7，70.4，69.1，68.6，58.0，31.2，21.5，17.6；元素分析实验值（%，C90H112O26N8S4F12Ru4理论值）：C，43.54（43.03），H 4.55（3.90），N 4.51（4.80）.

1.2.7 组装体9的合成及表征Ru2（4 μmol，3.6271 mg）与配体3（4 μmol，1.4897 mg）反应得到组装体9，红色固体粉末，产率为55%.1H NMR（400 MHz，CD3CN），δ：7.94~7.89（m，4H），7.56（s，4H），7.11（d，J=1.9 Hz，2H），6.74（d，J=1.4 Hz，4H），6.47（d，J=1.8 Hz，8H），5.93（d，J=6.1 Hz，8H），5.84（s，4H），5.74（d，J=6.1 Hz，4H），4.04~3.95（m，4H），3.93~3.91（m，4H），3.85~3.79（m，4H），3.71~3.63（m，4H），3.55~3.48（m，4H），3.38~3.31（m，4H），3.03（s，4H），2.78（p，J=6.9 Hz，4H），2.21（s，12H），1.27（d，J=6.9 Hz，24H）；13C NMR（100 MHz，CD3CN），δ：183.9，159.9，138.4，137.2，130.0，122.8，120.4，119.6，107.3，106.3，101.9，101.4，99.4，84.1，80.7，71.3，70.2，70.1，57.8，31.2，21.6，17.6；ESI-MS实验值（［M−2OTf］2+理论值），m/z：1131.15576（1131.15489）；元素分析实验值（%，C94H120O28N8S4F12Ru4理论值）：C 43.92（43.05），H 4.71（3.95），N 4.36（4.41）.

1.2.8 组装体10的合成及表征Ru3（4 μmol，3.8274 mg）与配体1（4 μmol，0.9610 mg）反应得到组装体10，墨绿色固体粉末，产率为67%.1H NMR（400 MHz，CD3OD），δ：8.42（s，2H），7.52（s，4H），7.19（s，8H），7.15（d，J=3.4 Hz，4H），6.85（s，4H），5.85（d，J=5.9 Hz，8H），5.63（d，J=5.9 Hz，8H），3.85（s，6H），2.82（p，J=6.8 Hz，4H），2.12（s，12H），1.31（d，J=6.9 Hz，24H）；13C NMR（100 MHz，CD3OD），δ：170.9，137.8，137.1，129.1，119.7，111.5，106.1，102.6，100.0，99.7，84.9，84.7，81.4，55.5，30.7，21.1，16.2，14.0；元素分析实验值（%，C90H100O22N8S4F12Ru4理论值）：C 44.92（45.93），H 4.19（3.71），N 4.66（4.35）.

1.2.9 组装体11的合成及表征Ru3（4 μmol，3.8274 mg）与配体2（4 μmol，1.3134 mg）反应得到组装体11，墨绿色固体粉末，产率为61%.1H NMR（400 MHz，CD3OD），δ：8.24（s，4H），7.54（d，J=1.6 Hz，4H），7.19（s，8H），7.14（s，4H），6.90（s，4H），6.49（d，J=1.8 Hz，4H），5.84（d，J=6.1 Hz，8H），5.61（d，J=6.1 Hz，8H），3.97（d，J=5.4 Hz，4H），3.93（d，J=4.9 Hz，4H），3.81~3.77（m，4H），3.60~3.56（m，4H），3.27（s，6H），2.87~2.71（m，4H），2.13（s，12H），1.29（d，J=6.9 Hz，24H）；13C NMR（100 MHz，CD3OD），δ：170.8，160.3，137.9，137.5，137.2，129.8，120.0，111.4，107.1，102.5，99.9，84.6，81.4，71.7，71.5，70.2，69.0，68.4，57.7，30.7，21.1，16.2；元素分析实验值（%，C98H116O26N8S4F12Ru4理论值）：C 45.58（45.04），H 4.53（3.87），N 4.34（4.48）.

1.2.10 组装体12的合成及表征Ru3（4 μmol，3.8274 mg）与配体3（4 μmol，1.4897 mg）反应得到组装体12，墨绿色固体粉末，产率为55%.1H NMR（400 MHz，CD3OD），δ：8.19（s，4H），7.54（s，4H），7.21（s，8H），6.89（s，4H），6.36（s，4H），5.86（d，J=6.0 Hz，8H），5.63（d，J=6.0 Hz，8H），3.95（d，J=3.4 Hz，4H），3.86（q，J=4.6 Hz，4H），3.70（t，J=4.5 Hz，4H），3.63（dd，J=5.6，3.3 Hz，4H），3.57（q，J=4.5 Hz，4H），3.40（dd，J=5.7，3.3 Hz，4H），3.08（d，J=0.9 Hz，4H），2.81（p，J=7.0 Hz，4H），2.15（s，12H），1.30（d，J=6.8 Hz，24H）；13C NMR（100 MHz，CD3OD），δ：170.8，160.0，138.2，137.5，137.3，129.9，122.0，120.1，118.8，111.5，107.2，102.4，100.1，84.8，81.3，71.3，70.5，70.2，69.9，68.4，57.5，30.7，21.1，16.2；ESI-MS实验值（［M−2OTf］2+理论值），m/z：1181.16891（1181.67445）；元素分析实验值（%，C106H124O28N8S4F12Ru4理论值）：C 46.82（44.06），H 4.60（3.82），N 4.12（4.25）.

1.3 组装体晶体的生长

将5 mg组装体4溶于1 mL甲醇溶液中，过滤，用移液枪将溶液转移到核磁管中，缓慢地加入1 mL乙醚，用封口膜将核磁管密封，然后放到稳定的环境中待晶体的生长，5 d后核磁管内壁上出现黄色晶体4.

1.4 组装体的紫外⁃可见吸收光谱测定

在室温下，分别将配体1~3，半三明治钌（Ⅱ）Ru1~Ru3及组装体4~12溶解在甲醇中（溶液的浓度为1×10−5mol/L），采用紫外-可见分光光度计测其吸收光谱.

1.5 组装体的脂水分配系数测定

采用“摇瓶法”测定组装体的脂水分配系数.将组装体以不同的浓度溶解在超纯水中，通过紫外-可见光谱测其吸光度，然后根据浓度和吸光度的关系绘制标准曲线.将组装体分别溶于水相、有机相（正辛醇）中，在振荡器上振荡24 h，然后离心测定水相的吸光度.通过与标准曲线的对比计算出组装体在水相浓度（cw，mol/L），然后计算组装体在有机相浓度（co，mol/L），将实验重复3次取平均值，组装体的脂水分配系数（Po/w）根据公式lgPo/w=lg（co/cw）计算.

1.6 细胞毒性测试

利用噻唑蓝（MTT）比色法，对A549，MDA-MB-231，HepG-2，MCF-7，HBE和THLE-2细胞进行体外抑制活性测试.将组装体4~12、半三明治钌（Ⅱ）Ru1~Ru3、配体1~3，及商品化的顺铂和阿霉素（作为阳性对照组）以2倍梯度浓度加入到细胞培养液中，样品的浓度范围为0.10~100.00 μmol/L.将细胞置于培养箱中培养48 h，加入MTT溶液培养4 h，然后用DMSO溶解细胞代谢产物，通过酶标仪测试溶液的吸光度，通过吸光度值可以计算出各化合物的半抑制浓度（IC50，μmol/L）和半数毒性浓度（TC50，μmol/L）值.

1.7 金属Ru的细胞摄取测定

将密度为1×106cell/mL的A549和HBE细胞分别接种到培养皿中，将组装体10~12分别加入到培养皿中，在细胞培养箱中培养24 h.培养结束后的细胞用PBS缓冲溶液洗涤3次，添加胰蛋白酶到培养皿中消化细胞，对消化过后的细胞进行计数.离心后弃去上层清液，在下层细胞中加入体积分数为60%的硝酸，硝化24 h.硝化结束后用超纯水稀释样品，使样品中硝酸的浓度低于5%.最后，使用电感耦合等离子体质谱测定细胞中钌离子的含量.

1.8 紫外⁃可见光谱测定CT⁃DNA与组装体的结合实验

制备浓度为5 mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐-酸盐（Tris-HCl）缓冲液（pH≈7.2）.将组装体溶解于DMSO中，然后用Tris-HCl缓冲溶液稀释至5×10−5mol/L.将CT-DNA溶解于缓冲溶液中，测定UV-Vis光谱，确定其在260 nm处的吸光度，通过公式计算CT-DNA的浓度，然后以2倍梯度稀释到0~0.1 mmol/L.将不同浓度的CT-DNA溶液（0，0.0125，0.025，0.05或0.1 mmol/L）加入到浓度为5×10−5mol/L的组装体溶液中，用紫外-可见分光光度计测其吸光度，以缓冲溶液为空白对照.结合常数（Kb）根据Benesi-Hildebrand公式A0/（A-A0）=ɛf/（ɛb-ɛf）+ɛf/Kb（ɛb-ɛf）［DNA］（其中，A0为没有加入CT-DNA时的吸光度；A为加入CT-DNA后的吸光度）计算.

1.9 组装体与插入溴化乙锭的CT⁃DNA作用的实验

首先，配制浓度为5 mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液，调节pH值至7.2.配制组装体浓度为5 mmol/L的甲醇溶液，用Tris-HCl缓冲溶液稀释至0~6 μmol/L，备用.用Tris-HCl缓冲溶液配制浓度为40 μmol/L的溴化乙锭浓度为50 μmol/L的CT-DNA溶液［根据公式A=6600 L·mol−1·cm−1×c×1 cm确定CT-DNA浓度，其中，c（μmol/L）为CT-DNA的浓度；A为CT-DNA的吸光度，A≈0.33时浓度为50 μmol/L］；将4 mL该混合溶液加入到比色皿中，加入不同浓度的组装体溶液，在荧光分光光度计中记录荧光强度.根据测得的荧光强度与组装体浓度的关系计算出溴化乙锭和CT-DNA的混合溶液的猝灭关系，根据Stern-volmer方程式I0/I=1+Ksv［Complex］计算出猝灭常数（Ksv），再根据公式Kapp×［Complex］=KEtBr×［EtBr］（KEtBr=1.0×107）求出组装体的插入常数，以上数据处理均采用Origin软件.

1.10 组装体对斑马鱼的急性毒性实验

将野生AB型斑马鱼的受精卵按照每个孔板1枚卵的方式置于96孔板中，将组装体浓度为0，6，12，24和48 μmol/L的DMSO溶液及48 μmol/L顺铂的DMSO溶液分别加入到上述带有鱼卵的孔板中，用显微镜观察斑马鱼卵并分别记录0，24，48和72 h时斑马鱼生长情况并进行统计，每次观察后再将96孔板放回温度为28.5℃的培养箱中继续培养.

1.11 组装体对斑马鱼体内肿瘤的抑制实验

将野生AB型斑马鱼卵放入恒温培养箱中培养48 h，待斑马鱼卵孵化.向复苏并传代后的A549癌细胞培养液中加入DiI（细胞膜红色荧光探针），放入培养箱中染色30 min，备用.向斑马鱼的培养液中加入3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐，对斑马鱼进行麻醉.将麻醉后的斑马鱼平铺在琼脂板上，使用微型注射器将荧光染色后的A549细胞注入斑马鱼体内，每条鱼注射量控制在0.2 nL，将处理过的斑马鱼放回培养液中并加入黑色素抑制剂.培养24 h后按照上述方法再进行一次组装体的注射并补加入一些培养液.将斑马鱼置于荧光显微镜下拍照并记录0，24，48及72 h时的变化情况.用Image J软件对照片的相对荧光强度进行计算.

2 结果与讨论

2.1 组装体的合成与结构表征

配体1~3的合成步骤见本文支持信息，图S1~图S3（见本文支持信息）给出分离提纯的配体1~3的1H NMR数据.通过1H NMR，13C NMR，ESI-MS和元素分析表征了组装体4~12（Scheme 1），其1H NMR数据见本文支持信息图S4~图S12.

通过溶剂扩散法得到组装体4的单晶.图1为其晶体结构的热椭球图（ORTEP），表1列出了其晶体学数据.由图1可以看出，组装体4是具有矩形结构的金属大环，晶体的最小不对称单元见图1（A），图1（B）为组装体4的完整结构单元（对称轴为1-x，y，1.5-z）.Ru（1）—Ru（2）之间的距离分别为0.5561和0.9244 nm，配体3号位的氮原子与3'号位的氮原子相距0.551 nm，2个配体上的氧原子相距0.332 nm.可以看出，2个配体1与接受体半三明治钌（Ⅱ）Ru1配位后2个配体1的取向一致，这样的组装体稳定性较好.

Fig.1 ORTEP structure of assembly 4

Table 1 Selected crystallographic data for assembly 4

2.2 组装体的紫外⁃可见吸收研究

图2 给出配体1~3，Ru1~Ru3和组装体4~12在甲醇中的紫外⁃可见吸收光谱.烷基链的长度对1，3-双咪唑基苯配体1~3的吸收光谱基本没有影响［图2（A）］，最大吸收峰位于287 nm，可以归属为分子内的π→π*电子跃迁.组装体4~6的紫外吸收光谱与相应的草酸型Ru1前体类似，最大吸收峰位于217 nm处；组装体7~9的吸收光谱与相应的苯醌型Ru2前体也非常相似，在226，400和495 nm附近有强的吸收峰；与相应的苯醌型Ru3类似的组装体10~12也有类似的3个吸收峰.不同类型的Ru前体具有不同吸收峰是由于Ru（Ⅱ）与配体之间的电子转移难易不同而产生的［35］.组装体4~12在224~298 nm处的最强吸收峰可以归属为π→π*电子跃迁，峰的强度比相应的Ru单体明显增强［36，37］.399~496 nm处的吸收峰可能是接受体内部的金属-配体之间电荷转移（MLCT）的结果.

2.3 组装体的体外抗癌活性研究

组装体4~12及相应的配体1~3和Ru1~Ru3对细胞株A549，MDA-MB-231，HepG-2及MCF-7的MTT实验结果见表2.结果表明，配体1~3对4种肿瘤细胞基本没有毒性（IC50＞100 μmol/L）.草酸型和苯醌型的Ru前体（Ru1和Ru2）及其组装体4~9均未表现出对这些肿瘤细胞的抑制活性，而萘醌型的组装体10~12对4种肿瘤细胞均表现出高的细胞毒性（IC50<2.22 μmol/L），说明Ru接受体的结构类型对细胞的毒性有很大影响，这与文献［31］实验结果一致.虽然萘醌型的Ru前体（Ru3）也对这些肿瘤细胞有一定毒性，但其组装体10~12的毒性明显改变，表明组装体的抗癌活性是由给体与接受体协同作用所致.组装体10~12对A549细胞的毒性是顺铂的10倍以上，是阿霉素的2倍以上，说明组装体10~12对肺癌有较好抑制作用.顺铂对MDA-MB-231的毒性较低（IC50＞50 μmol/L），组装体10~12对MDA-MB-231有很好的抑制活性，其中组装体12的IC50为（0.08±0.02）μmol/L，是阿霉素的3倍以上.组装体10~12对HepG-2的抑制能力明显优于顺铂，对MCF-7的抑制能力接近顺铂，但均不如阿霉素.

Fig.2 UV⁃Vis absorption spectra of ligands 1—3(A),Ru1 and assemblies 4—6(B),Ru2 and assemblies 7—9(C)and Ru3 and assemblies 10—12(D)in methanol

Table 2 Cytotoxicity of ligands 1—3,Ru1—Ru3,assemblies 4—12,cisplatin and doxorubicin against cancer cell lines in vitro in 72 h

为了进一步探究组装体对癌细胞和正常细胞的选择性，选取对癌细胞有抑制作用的组装体10~12，选择2种癌细胞A549和HepG-2，以及对应的2种正常细胞HBE和THLE-2进行实验.表3中SIa表示组装体对HBE的半数毒性浓度比对A549的半数抑制浓度，SIb表示组装体对THLE-2的半数毒性浓度比对HepG-2的半数抑制浓度.实验结果表明，组装体10~12对A549的选择性均好于顺铂和阿霉素，其中组装体12的选择性指数高达2.29.在HepG-2与THLE-2对照组中，组装体10~12与顺铂均没有阿霉素的选择性好，与顺铂相比，组装体10~12对肝癌细胞的抑制效率更高.综上所述，组装体10~12对A549/HBE的选择性较好，优于顺铂和阿霉素.

Table 3 Selectivity comparison of assemblies 10—12,cisplatin and doxorubicin to A549 and HBE,HepG⁃2 and THLE⁃2*

2.4 组装体的细胞摄取性能

为了确定抗癌活性是否与组装体在细胞中的摄取量有关，测试了A549和HBE细胞对组装体10~12中Ru的摄取量，结果如图3所示.组装体10，11和12在A549细胞中的浓度分别为0.832，0.206和0.374 nmol/106cells；它们在HBE细胞的浓度分别为0.458，0.054，0.107 nmol/106cells，即肿瘤细胞A549对各组装体的摄取量均大于正常细胞HBE，此结果与上述组装体对肿瘤细胞具有较好的选择性一致.由于组装体10~12的结构略有差异，导致各组装体在A549和HBE中摄取量略有不同，它们对Ru化合物的摄取量顺序为10＞12＞11，但组装体对A549的毒性顺序为11＞12＞10，对HBE的毒性顺序为11＞10＞12，说明组装体的抗癌活性与细胞摄取有一定关系，但还与其它因素有关［38］.

Fig.3 Concentrations of Ru of assemblies 10—12 in A549 cells and HBE cells

2.5 组装体10~12的脂水分配系数

带有不同长度烷基链的组装体（10~12）的亲水性和亲脂性有所不同，实验测得10~12的脂水分配系数（lgPo/w）分别为0.176，0.41和0.549，其中组装体10的亲水性更好，而组装体12的亲脂性更好，亲脂性大小顺序为12＞11＞10，与A549和HBE细胞对化合物的摄取量顺序略有不同（10＞12＞11），因此细胞对组装体的吸收效率不完全取决于药物的亲脂性.组装体10~12的lgPo/w值在−0.4~5.6之间，具有开发成临床药物的潜力.

2.6 组装体10~12与CT⁃DNA的结合作用

了解Ru组装体与DNA相互作用方式对于探索此类物质的抗癌机制非常重要.利用紫外-可见吸收光谱研究了组装体10~12与DNA的相互作用，结果见图4.随着CT-DNA浓度（0，0.013，0.025，0.050，0.100 mmol/L）的增加，组装体10~12的最大吸收峰发生稍微的增色效应和红移（10：Δλ=7 nm，ΔI=0.02；11：Δλ=3 nm，ΔI=0.01；12：Δλ=10 nm，ΔI=0.01），说明CT-DNA与组装体10~12是通过静电结合模式与DNA相互作用［31］.组装体10~12的结合常数（Kb）分别为1.45×105，3.2×104和1.8×104L/mol，组装体10的结合常数最大.组装体10~12是由萘醌钌（Ⅱ）Ru3与咪唑基配体1~3构成的，因此结合常数的不同是由于咪唑配体的不同导致，其规律是随着咪唑配体带的烷氧基链的增长，结合常数降低，这可能是由于位阻作用造成的.

Fig.4 UV⁃Visible spectra of assemblies 10(A),11(B)and 12(C)upon titration of CT⁃DNA（0—0.1mmol/L）

EB通常被用于DNA的检测和定位，利用荧光光谱研究了组装体10~12与溴化乙锭对CT-DNA插入的竞争作用.结果［图5（A），（C）和（E）］显示，随着加入组装体10~12浓度的增加，插入EB的DNA溶液的荧光强度逐渐减弱.这是因为组装体代替EB插入到CT-DNA中，使得插入DNA中EB的含量降低，引起荧光猝灭.组装体的浓度与荧光猝灭具有线性关系［图5（B），（D）和（F）］，组装体10~12的插入常数（Kapp）分别为2.9×108，3.1×108和2.7×108L/mol，组装体11的插入常数最大，说明其与DNA的结合力最强.根据组装体与荧光强度的关系计算出组装体10~12的猝灭常数（Ksv）分别为3.9×105，4.0×105和3.4×105L/mol.结合前面的实验可以发现，组装体的插入常数大于相应的静电结合常数，说明组装体与DNA的结合方式主要是插入作用，同时也存在部分的静电作用.

Fig.5 Fluorescence quenching graphs(A,C,E)and Stern⁃Volmer graph of I0/I versus concentration(B,D,F)of the mixed solution of EB⁃CT⁃DNA with different concentrations of assemblies 10(A,B),11(C,D)and 12(E,F)

2.7 组装体12对斑马鱼卵的毒性研究

由表4可知，48 h内未加组装体2的斑马鱼卵全部孵化.加入浓度为6 μmol/L的组装体12实验组中斑马鱼也全部孵化.当组装体浓度升高到12 μmol/L时，斑马鱼存活率为90%，因为所含金属的量与48 μmol/L顺铂相当，说明组装体12表现出了较低的生物毒性.与空白对照组相比，加入药物的实验组出现了孵化减慢的情况，说明药物进入斑马鱼胚胎内，对其孵化产生了一定的影响.这可能是因为：一方面，组装体化合物在缓冲溶液中的溶解度较低，有部分组装体析出附着在卵膜上（附着在卵膜上的组装体可以通过显微镜观察到），导致斑马鱼无法呼吸而出现死亡；另一方面，组装体12进入到卵内与斑马鱼胚胎相互作用，抑制了斑马鱼的孵化.

Table 4 Effect of cisplatin and assembly 12 on hatchling and survival rate of zebrafish eggs

2.8 组装体12对斑马鱼体内肿瘤抑制的研究

Fig.6 Relative fluorescence intensity of zebrafish containing A549 tumor cells vs.time and concentration of complex 12

选取实验结果相对较好的组装体12进行斑马鱼的体内抗肿瘤实验.分别将浓度为10和20 μmol/L的组装体溶液注入提前植入含有荧光剂的A549细胞的斑马鱼体内，每组30条鱼，并设立空白对照组.在荧光显微镜下观察并且记录肿瘤细胞的荧光强弱（图6）.实验发现，在空白对照组中随着时间变化肿瘤细胞逐渐增多.在实验组中，随着时间的推移肿瘤细胞逐渐死亡，荧光强度逐渐减弱，而在20 μmol/L的实验组中肿瘤细胞的荧光减弱现象最为明显.综上所述，组装体12有较好的体内抗肿瘤活性，而且有较低的生物毒性.

综上所述，本文研究了配体1~3与半三明治钌（Ⅱ）Ru1~Ru3通过配位驱动的自组装构建的［2+2］矩形大环组装体4~12.通过核磁氢谱、核磁碳谱、元素分析及X射线单晶衍射分析对组装体的结构进行了表征，证实得到了目标产物.测试了组装体的紫外⁃可见吸收光谱，表明MLCT效应使组装体的吸光度明显增强.评估了组装体对A549，MDA-MB-231，HepG-2，MCF-7人癌细胞的抗肿瘤活性，且以A549/HBE与HepG-2/THLE-2为实验组探究了组装体对癌细胞及正常细胞的选择性.结果表明，组装体10~12具有较好的抑癌作用以及较好的选择性.通过紫外-可见光光谱以及荧光光谱探究了组装体的抗癌机理.结果表明，组装体与DNA作用的主要方式是插入作用.脂水分配系数实验表明，烷基链的长度对组装体的亲脂性有重要影响.细胞摄取实验表明，抗癌活性与组装体在细胞内的摄取量有关.采用斑马鱼卵对组装体12的急性毒性进行了评价，发现组装体12对斑马鱼卵的毒性相对较小，与顺铂相当.在斑马鱼体内肿瘤实验中，随着时间的推移荧光逐渐减弱，说明组装体12在斑马鱼体内有较好的抑癌效果.

支持信息见http：//www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20210407.