基于肿瘤标志物OATP1B3的近红外荧光染色用于鉴别口腔鳞癌

崔娟娟 马晓楠

摘要：目前口腔癌的诊断方法均存在一定的局限性，临床上仍需一种快速、准确、简便的方法来诊断口腔部位病变细胞，而近红外荧光染色有可能填补这一空白。通过分析数据库中肿瘤特异性亲和的近红外荧光染料IR-783的转运体OATP1B3在癌症组织中表达特征，发现转运体的高表达与口腔鳞癌患者生存期缩短相关。另外，体外试验中IR-783染色容易区分出口腔鳞癌细胞与非癌细胞，提示OATP1B3有可能作为口腔癌诊断的标志物，而IR-783染色可以成为潜在的口腔癌诊断方法。

关键词：口腔癌;近红外荧光;OATP1B3

头颈部肿瘤包括颈部肿瘤、耳鼻喉科肿瘤以及口腔颌面部肿瘤三大部分。口腔颌面部恶性肿瘤发病率仅次于鼻咽癌，居头颈部恶性肿瘤的第2位。每年新发口腔癌患者数约占新发头颈部肿瘤的15%。口腔癌是一种高度致死的癌症，致死率接近50%[1]。目前，口腔癌的诊断方法主要有两种，即影像学检查和细胞学/组织活检，但临床上仍需要一种快速、准确、简便的方法来诊断口腔部位病变细胞。所以考虑应用一些对癌细胞有特异亲和力的荧光染料，借助显微成像系统进行诊断，形成一种全新、安全、高效的高分辨率实时影像学诊断系统。小分子近红外荧光染料IR-783是一种水溶性阳离子七甲川花菁染料，以前被用来测量血流量和心输出量，如今，人们注意到了它的一种重要特性：IR-783很容易穿透生物膜结构，可以特异性地富集于癌细胞的线粒体中。IR-783在癌细胞线粒体中的富集依赖于有机阴离子转运体OATP1B3（由SLCO1B3基因编码）。OATP1B3在许多种类的肿瘤细胞中都有高表达，但具体表达水平和表达机制均未知。本研究将通过分析数据库中OATP1B3在癌症组织中表达特征，分析OATP1B3是否适合作为口腔癌的诊断标志物，并考察IR-783是否富集于肿瘤细胞中，从而使IR783染色成为潜在的口腔癌诊断方法。现报道如下：

1材料与方法

基因表达资料交互分析：GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn/detail.php）在线程序被用于分析和比较TCGA及GTEx数据，得到SLCO1B3在不同组织的分布情况。线箱图用于比较多种肿瘤与对应的正常组织中SLCO1B3表达差异是否有统计学意义，|log2FC|临界值设定为1，P值临界值设定为0.01，其余为默认值。

生存分析：GEPIA的生存分析（包括了总体生存期与无病生存期）模块中用时序检验（Log-rank test）作为假设检验（hypothesis test）。SLCO1B3表达的中位数作为临界值。

近红外荧光染料染色及荧光观察：细胞数相同的人口腔鳞癌细胞CAL-27与人胚胎肾细胞HEK293共培养于DMEM培养基中（含有10% FBS，1%青霉素-链霉素双抗）。细胞铺板8h后，在培养基中加入10 nmol/L IR-783，37℃避光孵育10 min，弃去培养基后用冷的PBS洗3次，加入新鲜培养基后40倍物镜相差及荧光显微镜观察并拍照（Olympus IX71，荧光激发波长630 nm，发射波长780 nm）。

2结果

2.1 OATP1B3在肿瘤和正常组织中的表达差异

基因表达资料交互分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis， GEPIA）被用于比较TCGA及GTEx数据，得出OATP1B3（SLCO1B3）在正常组织或器官和对应的肿瘤组织中的表达差异及差异是否有统计学意义。正常人体内，OATP1B3仅在肝脏和胆囊高表达，而在其他组织中几乎观察不到表达。但在小肠以外的其他消化系统肿瘤中存在表达水平升高的情况（图1A、B）。相反，与正常肝脏和胆囊相比，在肝癌和胆囊癌组织中OATP1B3表达量却降低（图1B）。对表达差异进行统计分析后发现，只有结肠腺癌、食道癌、头颈癌、肝癌和胆囊癌中SLCO1B3的表达与正常组织对照相比有显著性差异（P<0.01，图1C、D）。提示SLCO1B3的表达可能与这五种癌症发生与进展相关。

2.2 SLCO1B3表达与癌症病人生存期相关性分析

为了明确SLCO1B3的表达对这几种癌症病人预后的影响，GEPIA被用于分析基因表达与患者生存期之间的相关性。泛癌分析结果显示SLCO1B3的高表达患者明显有着更短的总体生存期与无病生存期（图2A、B）。而结肠腺癌、食道癌、头颈鳞癌患者SLCO1B3的高表达与生存期缩短显著相关（图2C），尤其是头颈鳞癌患者SLCO1B3的高表达意味着更差的预后（图2D）。另外，肝癌和胆囊癌患者SLCO1B3的表达对总体生存期与无病生存期均无显著性影响（图2E、F）。以上结果提示SLCO1B3的表达对头颈鳞癌患者预后影响较大。

2.3 OATP1B3介导的IR-783在口腔癌细胞中富集

作为头颈部肿瘤重要的一类，口腔癌鳞细胞是否可以通过表达OATP1B3而富集近红外荧光染料并无报道。为了观察IR-783是否可以特异性染色口腔癌细胞，人口腔鳞癌细胞CAL-27与人胚胎肾细胞HEK293共培养，经IR-783染色后进行白光及近红外荧光观察。结果显示IR-783在CAL-27细胞中特异性富集，而在HEK293细胞中几乎没有富集（图3）。而CAL-27细胞红外荧光信号很强烈（图3B），293细胞几乎不被红外染料着色，很难将其与背景分开，两种细胞染色对比度达到100：1。使用IR783，能够清楚的区分两种细胞。

3讨论

根据已有文献报道，IR-783可以在多种肿瘤细胞系及裸鼠的异体移植肿瘤中富集，显示出其作为癌症诊断试剂的价值，但哪些肿瘤可以富集IR-783并不清晰，限制了其应用。本研究从IR-783的转运体OATP1B3的表达出发，明确了SLCO1B3基因在肿瘤与配对正常组织中表达的差异，及SLCO1B3高表达与患者生存期缩短的的相关性。在此基礎上证明了口腔鳞癌细胞易于富集IR-783，而这种近红外荧光染料有成为口腔癌诊断试剂的潜力。

参考文献

[1]赵友，周烨，崔笠，等.基于代谢组学的前列腺癌肿瘤标志物研究进展[J].肿瘤学杂志，2020，26（2）：78-82.