2013—2019年我国流行性出血病病毒血清1型毒株的分离与遗传特征分析

李卓然 吴健敏 朱建波 王金萍 吕敏娜 肖雷 杨振兴 廖德芳 李华春 杨恒

李卓然（1985-），博士，主要從事动物虫媒病毒遗传学及病毒免疫学研究工作。先后主持或参与国家自然科学基金项目、国家重点研发计划项目、农业部公益性行业（农业）科研专项及云南省基础研究计划项目等科研项目8项;现主持国家自然科学基金项目“蓝舌病病毒抑制JAK-STAT通路内I型干扰素信号传导机制研究”和云南省基础研究计划项目“BTV非结构蛋白NS3和NS4拮抗JAK-STAT通路内IFN-I信号传导机制研究”，并入选2020年云南省高层次人才培养支持计划“青年拔尖人才”专项。以第一作者在《PNAS》《Emerging Infectious Diseases》《Veterinary Microbiology》《Virology Journal》《BMC Veterinary Research》《病毒学报》《农业生物技术学报》《南方农业学报》等国内外科技期刊上发表学术论文10余篇。

摘要：【目的】掌握流行性出血病病毒（Epizootic haemorrhagic disease virus，EHDV）血清1型毒株（EHDV-1）在我国南方地区的流行情况及其遗传特征，为开展EHDV-1血清型特异性诊断、流行病学调查和致病性研究提供科学依据。【方法】2013—2019年通过在我国云南、广东和广西设立牛羊虫媒病毒监控点和哨兵牛，定期采集哨兵牛血液样本进行虫媒病毒分离;通过微量中和试验确定EHDV分离株的血清型，然后对EHDV分离株的部分基因节段（Seg-2、Seg-3和Seg-6）进行RT-PCR扩增、双向测序及序列分析，并利用BioEdit计算EHDV基因组各节段核苷酸序列及其推导氨基酸序列的相似性。【结果】2013—2019年从云南、广东及广西的虫媒病毒监控点共分离获得33株EHDV，其中7株为EHDV-1型毒株。分离获得的7株EHDV-1型毒株Seg-2、Seg-3和Seg-6核苷酸序列高度同源，其平均相似性分别为（97.65±1.51）%、（94.87±4.72）%和（97.61±1.41）%，对应的推导氨基酸序列相似性平均为（97.69±1.36）%、（99.49±0.32）%和（97.51±2.47）%。基于Seg-2、Seg-3和Seg-6核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树均显示，不同EHDV-1型毒株可划分为东方（Eastern）和西方（Western）2种地域型，东方地域型毒株分离自中国、日本及澳大利亚，西方地域型毒株主要来源于美洲和非洲。在基于Seg-2核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树中，分离获得的7株EHDV-1型毒株归属于西方地域型，且聚类形成一个相对独立的进化分支;在基于Seg-3核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树中，分离获得的7株EHDV-1型毒株分属2种地域亚型（Eastern-1和Eastern-2），分别与日本EHDV-1型和EHDV-6型毒株具有最近的亲缘关系;在基于Seg-6核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树中，分离获得的7株EHDV-1型毒株属于东方地域型，与日本EHDV-1型毒株具有较近的亲缘关系。【结论】EHDV-1型毒株已在我国南方地区广泛流行，其Seg-2和Seg-6序列分别具有最近的共有祖先病毒，而Seg-3序列来自不同的祖先病毒。西方地域型毒株Seg-2序列在我国流行EHDV-1型毒株中的出现，说明西方地域型毒株在侵入我国后可能与本土流行的毒株发生重配，即我国流行EHDV-1型毒株为西方地域型与东方地域型的重配型毒株，为防范强致病性西方地域型毒株传入我国而造成畜牧业重大经济损失提供了警示。

关键词： 流行性出血病病毒（EHDV）;EHDV-1型;病毒分离;遗传特征;重配

中图分类号： S852.65                            文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）08-0000-10

Isolation and genetic characterization of epizootic hemorrhagic disease virus serotype 1 strains prevalent in

China from 2013 to 2019

LI Zhuo-ran1，WU Jian-min2，ZHU Jian-bo1，WANG Jin-ping1，LYU Min-na3，XIAO Lei1，YANG Zhen-xing1，LIAO De-fang1，LI Hua-chun1*，YANG Heng1*

（1Yunnan Academy of Animal and Veterinary Science/Yunnan Key Laboratory of Tropical and Subtropical Animal Virus， Kunming  650224， China; 2Guangxi Veterinary Research Institute， Nanning  530001， China; 3Institute of Animal Health， Guangdong Academy of Agricultural Science/Guangdong Open Laboratory of Veterinary Public Health/Guangdong Provincial Key Laboratory of Animal Disease Prevention， Guangzhou  510640， China）

Abstract：【Objective】Mastering the prevalence and genetic characteristics of epidemic hemorrhagic disease virus（EHDV） serotype 1 （EHDV-1） strains in southern China provides basis for developing EHDV-1 serotype specific diagnosis methods， epidemiology investigation and pathogenicity research. 【Method】Cattle and sheep arbovirus monitoring sites and sentinel cattle were set up in Yunnan， Guangdong and Guangxi from 2013 to 2019. Animal blood samples were collected regularly for arbovirus isolation. The serotypes of isolated EHDV strains were determined by neutralization test， and the genomic segments（Seg-2， Seg-3 and Seg-6） of the isolated EHDV strains were amplified using RT-PCR， bidirectionally sequenced and analyzed. BioEdit was used to calculate the identities of the nucleotide and deduced amino acid sequences.【Result】A total of 33 EHDV strains were isolated from sentinel animals between 2013 and 2019 in Yunnan， Guangdong and Guangxi， including 7 EHDV-1 strains. Sequence analysis showed that the Seg-2，Seg-3 and Seg-6 nucleotide sequences of EHDV-1 strains isolated from Yunnan，Guangdong and Guangxi sharedhigh similarty， with average sequence identities of （97.65±1.51）%， （94.87±4.72）% and （97.61±1.41）%， respectively. The average sequence identities of the corresponding deduced amino acid sequences were （97.69±1.36）%，（99.49±0.32）% and （97.51±2.47）%， respectively. The phylogenetic trees based on nucleotide sequence similarity of Seg-2， Seg-3 and Seg-6 indicated that EHDV-1 strains could be divided into Eastern and Western topotypes. The Eastern topotype strains were usual-ly isolated from China， Japan and Australia， while the Western topotype strains mainly came from America and Africa. The phylogenetic trees based on nucleotide sequence similarity of Seg-2 indicated that the 7 EHDV-1 strains belonged to the Western topotype and formed an independent evolutionary branch on the phylogenetic tree. The phylogenetic trees based on nucleotide sequence similarity of Seg-3 indicated that the 7 EHDV-1 strains belonged to Eastern-1 and Eastern-2 sub-topotypes， and shared the closest relationship with Japanese EHDV-1 and EHDV-6 strains， respectively. The phylogenetic trees based on nucleotide sequence similarity of Seg-6 indicated that the 7 EHDV-1 strains belonged to the Eastern topotype branch， and possessed the closest relationship with EHDV-1 strains isolated from Japan. 【Conclusion】The EHDV-1 strains are widely prevalent in southern China. Seg-2 and Seg-6 sequences of EHDV-1 strains prevalent in southern China had the most recent common ancestor， respectively， while Seg-3 comes from different ancestral viruses. The emergence of Western topotype Seg-2 in EHDV-1 strains isolated from China indicatesthat Western topotype strains have reassorted with the local epidemic EHDV-1 strains after invading China， suggesting that the EHDV-1 strains prevalent in China are reassortant strains of the Western and the Eastern topotypes. The study provides a warning to prevent the invasion of highly pathogenic Western topotype strains into China and causing severe economic losses in animal industry.

Key words： epidemic hemorrhagic disease virus（EHDV）; EHDV-1 serotype; virus isolation; sequence analysis; reassortment

Foundation item：National Key Research and Development Program of China（2017YFC1200505，2016YFD050 0908）;Special Project for Agro-scientific Research in the Public Interest of Ministry of Agriculture and Rural Affairs （201303035）;Young and Middle-aged Academic and Technical Leaders Reserve Talents Training Project of Yunnan  （2017HB055）

0 引言

【研究意义】流行性出血病病毒（Epizootic hae-morrhagic disease virus，EHDV）引起的动物流行性出血病（Epizootic haemorrhagic disease，EHD）是一种严重危害反刍动物的虫媒病毒病，给养牛业带来巨大经济损失，已被世界动物卫生组织（OIE）列为法定报告的跨境动物疫病（Savini et al.，2011;Rath，2018）。目前，我国南方地区广泛流行的EHDV血清1型（EHDV-1）毒株的遗传背景尚不清楚，阻碍了全国EHDV流行病学研究与防控工作的开展。因此，开展EHDV-1型毒株的分离、鉴定和遗传特征分析，对掌握我国EHDV-1型毒株的流行情况及科学制定EHD防控策略具有重要意义。【前人研究进展】EHDV隶属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）环状病毒属（Orbivirus），通过库蠓（Culicoides spp.）叮咬进行传播，可感染牛、鹿及羊驼在内的多种家养和野生反刍动物（杨俊兴等，2009;Rath，2018）。EHDV基因组包含10个节段（Seg-1～Seg-10）双链RNA（Savini et al.，2011），其外层衣壳由Seg-2和Seg-6编码的VP2蛋白与VP5蛋白构成，具有高度变异的特性，是诱导中和抗体产生的主要蛋白，并決定着EHDV的血清型（Anthony et al.，2009b;Shirafuji et al.，2017）。参与构成病毒内层衣壳的VP3蛋白高度保守，但其编码基因Seg-3存在一定差异，据此可将世界范围的EHDV分为东方（Eastern）和西方（Western）2种地域型（Shirafuji et al.，2017;Anthony et al.，2009a）。至今，已发现9种血清型EHDV（EHDV-1、EHDV-2、EHDV-4、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8、EHDV-9和EHDV-10），不同血清型的地理分布区域不同，对动物的致病性也存在明显差异（Yadin et al.，2008;Sa-vini et al.，2011;Shirafuji et al.，2017;Brown-Joseph et al.，2019;Golender and Bumbarov，2019）。过去认为，只有日本EHDV-2型的茨城病毒（Ibaraki virus，IBAV）能导致牛出现类似蓝舌病的临床症状，而其他血清型EHDV均为隐性感染，但近年来EHDV不仅呈全球性扩散趋势，EHDV-1、EHDV-6和EHDV-7型毒株还在亚洲、中东地区、南非及北美洲引起EHD暴发（Temizel et al.，2009;Golender and Bumbarov，2019）。EHDV-7型毒株曾导致以色列牛场5%～80%的奶牛发病（Yadin et al.，2008;Temizel et al.，2009;Golender et al.，2017;Brown-Joseph et al.，2019）。在我国，吕敏娜等（2017）首次在广东省分离获得EHDV-1型毒株;随后，本课题组相继在云南、广东和广西的哨兵牛中分离出EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7和EHDV-10型毒株，并证实各血清型毒株的Seg-2、Seg-3和Seg-6序列均属东方地域型，与分离自日本或澳大利亚的毒株具有较近的亲缘关系（李占鸿等，2019，2020;杨振兴等，2019a，2019b，2020）。【本研究切入点】血清学调查结果显示，EHDV-1型毒株广泛流行于我国南方地区，但目前仅有1株EHDV-1型毒株的相关报道（吕敏娜等，2017），因此亟待掌握EHDV-1型毒株在我国南方地区的流行特征及其遗传背景。【拟解决的关键问题】通过设立牛羊虫媒病毒监控点和哨兵牛分离EHDV-1型毒株，并对其Seg-2、Seg-3和Seg-6序列进行比对分析，旨在掌握EHDV-1型毒株在我国南方地区的流行情况及其遗传特征，为开展EHDV-1血清型特异性诊断、流行病学调查和致病性研究提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

幼仓鼠肾细胞（BHK-21）和白纹伊蚊细胞（C6/36）由云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室保存提供;EHDV-1、EHDV-2、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7和EHDV-8型参考毒株由澳大利亚麦克阿瑟—伊丽莎白农业研究所惠赠，EHDV-10型毒株由云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室分离获得（李占鸿等，2019）;EHDV-1、EHDV-2、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8和EHDV-10型标准阳性血清由云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室制备提供。磁珠法病毒RNA抽提试剂盒、胎牛血清、Dulbeccos modified Eagles medium（DMEM）和Minimum Eagles medium（MEM）培养基购自Thermo公司，One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit试剂盒（Perfect Real Time）购自宝生物工程（大连）有限公司，HiScript Ⅱ One Step RT-PCR Kit试剂盒（Dye Plus）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，病毒DNA/RNA提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit及DNA胶回收试剂盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit购自北京全式金生物技术有限公司。

1. 2 引物设计与合成

根据GenBank已公布的EHDV-1型毒株基因组序列，利用Oligo 7.0设计3对引物（表1），用于EHDV-1型毒株Seg-2、Seg-3和Seg-6序列的扩增，扩增产物大小分别为913、1095和1130 bp，引物委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1. 3 监控动物设立及血液样本采集

2013—2019年，在云南师宗县、江城县和景洪市、广东汕头市及广西马山县和合浦县分别设立牛羊虫媒病毒监控点（表2），筛选蓝舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）和EHDV抗体检测呈阴性、年龄在1周岁的牛作为哨兵动物，共10头。哨兵牛不使用任何疫苗和驱虫药物，采取白天放牧，夜间赶回栏舍的方式进行饲养。每年5—10月，每周定期采集哨兵牛的全血、肝素钠抗凝血及EDTA抗凝血等3种血液样本，4 ℃冰盒保存，立即送回实验室进行虫媒病毒检测与分离。

1. 4 病毒分离与鉴定

取50.0 μL采集自哨兵牛的EDTA抗凝血样本，利用MagMax Express核酸自动提取仪提取EHDV核酸，参照杨振兴等（2019c）的方法对提取的核酸进行检测。取EHDV核酸检测呈阳性的动物血液样本（肝素钠抗凝血），离心收集红细胞，加灭菌水进行裂解。将裂解的红细胞接种至BHK-21细胞或C6/36细胞，并在BHK-21细胞上连续盲传3～5代，直至细胞出现明显的细胞病变（Cytopathic effect，CPE）。取200.0 μL出现CPE的细胞培养液，利用病毒DNA/RNA提取试剂盒提取核酸，94 ℃变性3 min后立即冰浴;然后参照杨振兴等（2019c）的方法，采用EHDV特异性实时荧光定量RT-PCR对分离病毒再次进行鉴定。

1. 5 微量中和试验

将待鉴定的病毒培养液进行10倍梯度稀释，每个稀释梯度的病毒培养液分别接种至96孔板（生长有单层BHK-21细胞），连续观察，并以Karber法测定分离病毒的TCID50。参照“Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2019”EHDV章节中的微量中和试验对EHDV分离株进行血清型鉴定，具体操作步骤：将EHDV-1、EHDV-2、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8和EHDV-10型标准阳性血清和EHDV标准阴性血清进行连续倍比稀释，取50.0 μL稀释后的血清与含100个TCID50病毒的待鉴定病毒培养液等体积混合，置于37 ℃培养箱中孵育1 h，加入100.0 μL密度为1.5×105 Cells/mL的BHK-21细胞;置于37 ℃培养箱中继续培养，逐日观察是否出现CPE，并计算血清中和指数。当阳性血清的中和指数大于75%则认为待鉴定毒株能被该血清型的阳性血清中和。

1. 6 RT-PCR扩增及双向测序

使用病毒DNA/RNA提取试剂盒提取EHDV分离株核酸，94 ℃变性3 min后立即冰浴。取5.0 μL变性核酸为模板，使用表1中的引物对，通過一步法RT-PCR（杨振兴等，2019d）扩增EHDV分离株的Seg-2、Seg-3和Seg-6序列，RT-PCR反应体系50.0 μL：One Step Enzyme Mix 2.5 μL，2×One Step Mix（Dye Plus）25.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，变性核酸模板5.0 μL，以无RNA酶水补足至50.0 μL。扩增程序：50 ℃反转录30 min;94 ℃预变性3 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，进行35个循环。取RT-PCR扩增产物进行电泳胶回收，以上、下游引物为测序引物，对纯化的DNA片段进行双向测序。

1. 7 序列分析与系统发育进化树构建

使用DNAStar 6.0对测序结果进行序列拼接和组装，以MEGA 6.0对EHDV基因组各节段核苷酸序列进行比对分析，并采用最大似然法（Maximum likelihood，ML）构建系统发育进化树（Tamura et al.，2013）。其中，Seg-2序列选择“GTR+G”模型，Seg-3序列选择“TN93+I”模型，而Seg-6序列选择“GTR+G+I”模型;自举检验（Bootstrap）取值为1000。在系统发育进化树中，其他国家和地区分离获得的EHDV参考株序列以“GenBank序列号_EHDV-血清型_分离国家/地区_病毒分离时间”表示。同时利用Bio-Edit计算EHDV基因组各节段核苷酸序列及其推导氨基酸序列的相似性，以平均数±标准差（Average±SD）表示。

2 结果与分析

2. 1 病毒分离与血清型鉴定结果

2013—2019年从云南、广东及广西的虫媒病毒监控点共分离获得33株EHDV（李占鸿等，2019，2020;杨振兴等，2019a，2019b，2020），微量中和试验鉴定结果显示，仅有7株EHDV分离株能被EHDV-1型标准阳性血清中和，其中云南4株、广东1株、广西2株（表2）。

2. 2 EHDV-1型毒株Seg-2、Seg-3和Seg-6序列RT-PCR扩增及测序结果

采用设计的3对引物（表1）对分离获得EHDV-1型毒株的Seg-2、Seg-3和Seg-6序列进行一步法RT-PCR扩增，结果显示，分别特异性扩增出大小约900、1000和1100 bp的目的DNA片段，与预期结果相符。利用BLAST对测序结果与GenBank已公布的序列进行比对分析，结果显示成功获得7株EHDV-1型毒株的Seg-2、Seg-3和Seg-6序列。

2. 3 EHDV-1型毒株Seg-2序列分析结果

利用BioEdit计算Seg-2核苷酸序列及其推导VP2氨基酸序列的相似性，结果表明，分离获得的7株EHDV-1型毒株Seg-2核苷酸序列相似性平均为（97.65±1.51）%，其推导VP2氨基酸序列相似性平均为（97.69±1.36）%（表3）;与世界范围内其他血清型EHDV的Seg-2核苷酸序列相似性在（46.63±0.05）%～（50.21±0.25）%，对应的推导VP2氨基酸序列相似性在（32.81±1.02）%～（38.74±0.33）%。基于Seg-2核苷酸序列相似性，可将不同血清型EHDV划分为4个群（Group A～Group D）（Anthony et al.，2009b;Shirafuji et al.，2017），所有EHDV-1型毒株均归属于Group C（图1）。分离获得的7株EHDV-1型毒株与美国、厄瓜多尔、尼日利亚及法国海外行政区（Guyane and Reunion Island）分离毒株构成西方地域型，其Seg-2核苷酸序列相似性为（73.07±0.13）%～（73.86±1.64）%，对应的推导VP2氨基酸序列相似性为（77.76±0.94）%～（78.01±0.64）%;與东方地域型（日本和澳大利亚）毒株的Seg-2核苷酸序列相似性仅为（69.66±0.21）%～（70.37±0.51）%，对应的推导VP2氨基酸序列相似性为（69.47±0.41）%～（71.31±0.59）%（表3）。在基于Seg-2核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树（图1）中，分离获得的7株EHDV-1型毒株聚类形成一个相对独立的进化分支，表明我国EHDV-1型毒株虽然与西方地域型毒株具有更近的亲缘关系，但在进化上存在着相对独立的起源。

2. 4 EHDV-1型毒株Seg-3序列分析结果

由表4可知，分离获得的7株EHDV-1型毒株Seg-3核苷酸序列相似性平均为（94.87±4.72）%，其推导VP3氨基酸序列相似性平均为（99.49±0.32）%;与世界范围内其他血清型EHDV的Seg-3核苷酸序列相似性在（79.11±0.51）%～（92.43±1.90）%，对应的推导VP3氨基酸序列相似性为（96.47±0.16）%～（99.57±0.16）%。基于Seg-3核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树（图2）显示，不同血清型EHDV也可划分为东方和西方2种地域型，分离获得的7株EHDV-1型毒株与日本分离毒株均属于东方地域型，其Seg-3核苷酸序列相似性平均为（94.17±2.66）%，对应的推导VP3氨基酸序列相似性平均为（99.40±0.23）%;与西方地域型（美国和尼日利亚）毒株的Seg-3核苷酸序列相似性在（79.57±0.40）%～（79.90±0.26）%，对应的推导VP3氨基酸序列相似性为（95.79±0.18）%～（96.47±0.16）%（表4）。此外，云南分离毒株和广东分离毒株均属于Eastern-2地域亚型，与来自日本的EHDV-1型毒株（LC202971）具有较近的亲缘关系，其Seg-3核苷酸序列相似性为（97.72±0.30）%，对应的推导VP3氨基酸序列相似性为（99.52±0.16）%;广西分离毒株则属Eastern-1地域亚型，与日本EHDV-6型毒株（LC320036）亲缘关系最近，其Seg-3核苷酸序列相似性为97.80%，对应的推导VP3氨基酸序列相似性高达99.70%，表明我国EHDV-1型毒株的Seg-3序列可能来自不同的祖先病毒。

2. 5 EHDV-1型毒株Seg-6序列分析结果

由表5可知，分离获得的7株EHDV-1型毒株Seg-6核苷酸序列相似性平均为（97.61±1.41）%，其推导VP5氨基酸序列相似性平均为（97.51±2.47）%;与世界范围内其他血清型EHDV的Seg-6核苷酸序列相似性在（59.3±0.73）%～（64.51±0.58）%，对应的推导VP5氨基酸序列相似性在（57.13±1.67）%～（64.08±1.64）%。基于Seg-6核苷酸序列相似性，可将不同血清型EHDV划分为4个群（Group A～Group D）（Anthony et al.，2009b;Shirafuji et al.，2017），所有EHDV-1型毒株均归属于Group C（图3）。基于Seg-6核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树显示，分离获得的7株EHDV-1型毒株与日本分离毒株均属于东方地域型，其Seg-6核苷酸序列相似性平均为（97.01±1.16）%，对应的推导VP5氨基酸序列相似性平均为（98.49±1.87）%;与西方地域型（美国和尼日利亚）毒株的Seg-6核苷酸序列相似性为（80.30±0.90）%～（80.56±0.95）%，对应的推导VP5氨基酸序列相似性为（93.79±1.66）%～（94.79±1.781）%（表3）。在系统发育进化树中，分离获得的7株EHDV-1毒株聚为一簇，表明我国EHDV-1型毒株的Seg-6序列可能来自共同的祖先病毒，且与日本分离毒株具有较近的亲缘关系，而与美国及非洲分离毒株的亲缘关系较远。

3 讨论

过去认为只有属于EHDV-2型的IBAV对牛具有较强致病性（Allison et al.，2010），但近年来发现EHDV-1、EHDV-6和EHDV-7型毒株在世界上多个国家和地区的牛群中引起EHD暴发（Temizel et al.，2009;Kamomae et al.，2018;Golender and Bumbarov，2019）。此外，随着气候变暖和蚊虫媒介活动范围的扩大，EHDV的流行区域呈逐步扩散趋势，不仅给养牛业带来巨大经济损失，还阻碍了家畜及畜产品的国际贸易（Kedmi et al.，2010;Yanase et al.，2020）。已有学者对我国流行EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7和EHDV-10型毒株的遗传特征进行研究报道（李占鸿等，2019，2020;杨振兴等，2019a，2019b，2020），但针对EHDV-1型毒株的报道仅吕敏娜等（2017）进行分离鉴定，因此亟待掌握我国EHDV-1型毒株的流行情况，防控EHDV向高海拔、高纬度和高寒地区扩散。本研究通过在我国云南、广东和广西设立牛羊虫媒病毒监控点和哨兵牛，成功分离获得7株EHDV-1型毒株，利用特异性引物分别扩增7株EHDV-1型毒株的Seg-2、Seg-3和Seg-6序列，并进行测序和进化分析。

本研究分离获得7株EHDV-1型毒株的Seg-2核苷酸序列及其推导VP2氨基酸序列高度同源，在基于Seg-2核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树中，7株EHDV-1型毒株聚类形成一个独特的中国进化分支，提示我国EHDV-1型毒株的Seg-2序列可能来自共同的祖先病毒。虽然7株EHDV-1型毒株共同构成中国进化分支，但分离自广西的2株病毒及分离自云南和广东的5株病毒分别聚类为两簇，说明我国流行EHDV-1型毒株的Seg-2序列在遗传特征上存在一定地域差异。此外，分离获得的7株EHDV-1型毒株与西方地域型毒株聚为一簇，而我国流行的EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7和EHDV-10型毒株均为东方地域型（李占鸿等，2019，2020;杨振兴等，2019a，2019b，2020），提示EHDV-1型毒株与我国流行的其他血清型EHDV的Seg-2序列起源不同，可能是西方地域型毒株早期侵入我国的结果，但在长期的进化过程中又形成一个相对独立的进化分支。

基于Seg-3核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树显示，分离自广西的2株病毒与分离自云南和广东的5株病毒分属不同地域亚型（Eastern-1和Eas-tern-2），提示我国EHDV-1型毒株的Seg-3序列可能来自不同的祖先病毒。此外，我国EHDV-1型毒株的Seg-3和Seg-6序列均属于东方地域型，且与日本分离毒株具有最近的亲缘关系。我国流行EHDV-1型毒株的Seg-2序列均来源于西方地域型毒株，而Seg-3和Seg-6序列均为典型的东方地域型，说明西方地域型毒株在侵入我国后可能与本土流行的毒株发生重配，类似情况也存在于BTV重配毒株中（Nomikou et al.，2015）。可见，虽然我国EHDV-1型毒株与属于西方地域型的EHDV-1型毒株分布区域相隔较远，但西方地域型的EHDV-1型毒株仍能侵入我国，给我国EHD的防控带来巨大挑战。由于目前尚未发现与我国EHDV-1型毒株Seg-2序列亲缘关系最近的西方地域型毒株，无法确定其祖先病毒，因此其来源及传入时间和传入途径尚未明确。

4 结论

EHDV-1型毒株已在我国南方地区广泛流行，其Seg-2和Seg-6序列分别具有最近的共有祖先病毒，而Seg-3序列来自不同的祖先病毒。西方地域型毒株Seg-2序列在我国流行EHDV-1型毒株中的出现，说明西方地域型毒株在侵入我国后可能与本土流行的毒株发生重配，即我国流行的EHDV-1型毒株为西方地域型与东方地域型的重配型毒株，为防范强致病性西方地域型毒株传入我国而造成畜牧业重大经济损失提供了警示。

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（責任编辑 兰宗宝）

收稿日期：2020-09-08

基金项目：国家重点研发计划项目（2017YFC1200505，2016YFD0500908）;农业部公益性行业（农业）科研专项（201303035）;云南省中青年学术和技术带头人后备人才培养项目（2017HB055）

通讯作者：李华春（1958-），https：//orcid.org/0000-0002-4284-1049，博士，研究员，主要从事动物虫媒病毒研究工作，E-mail：Li_huachun@hotmail.com;杨恒（1978-），https：//orcid.org/0000-0002-6447-2985，博士，研究员，主要从事动物虫媒病毒研究工作，E-mail：yangheng2008.cool@163.com

第一作者：李卓然（1985-），https：//orcid.org/0000-0001-8183-723X，博士，主要从事动物虫媒病毒遗传学及病毒免疫学研究工作，E-mail：lizhuoran85@126.com