N和O双同位素技术解析厌氧氨氧化分馏效应的研究进展

陈翠忠，孙志华，王健康，额热艾汗，李俊峰，吴心蓉，刘生宝，杜可清

(石河子大学 水利建筑工程学院，新疆 石河子 832000)

近年来随着污水处理技术的不断发展，新型生物脱氮技术——厌氧氨氧化将很好地克服传统脱氮过程中曝气能耗高、有机碳源不足、产生温室气体及污泥产量高等缺点[1-2]，同时能够实现污水厂能源中和甚至能量回收[3]。Strous等[4]通过化学计量和物料衡算推导出厌氧氨氧化反应方程式为：

+2.03H2O (1)

现阶段厌氧氨氧化菌的发现呈现多样化，菌种之间也存在差异性，菌种间的N和O迁移转化过程由于功能微生物的作用，产生的分馏效应也会呈现明显的不同，定性定量问题成为关键，针对于低含量的海洋氮素及地下水氮素已经不再制约质谱仪测定，而对于实际脱氮系统来说相对还较少，了解新型工艺的同位素特性可以揭示反应机理、诠释反应体系，为长期稳定运行提供可行性分析。

1 同位素转化及分析

1.1 溶解态三氮转化法

同位素质谱仪只能接受N2O、N2及CO2等简单气体进行测定，因此在进行同位素测定前均需要将溶解态物质转化为气态物质，以此来满足测定的要求。

表1 氮素转化方法对比Table 1 The comparison of nitrogen transformation methods

图1 氨氮转化过程Fig.1 The process of ammonia nitrogen conversion

图2 细菌反硝化测定同位素比值Fig.2 The isotope ratio of denitrification by bacteria

这种方法在测定过程中同时可以实现氮和氧双同位素的检测，通过动力学模型分析即可实现数据的准确分析。通过标准品校正可以了解到同位素分馏、同位素交换校正，标准品校正过程中发现，测定结合和给定值吻合度很好，可以作为转化的方法进行数据分析。采用细菌反硝化的方法大大节省了成本及运行时间，而且可以避免氮素之间的交叉污染。但培养细菌过程可能成为限制方法应用的前提条件，不仅要进行菌种的恢复和培养，而且还要保证菌种不被污染，大大限制了方法的灵活性。

图3 硝氮转化途径Fig.3 Nitrate transformation pathway

1.2 同位素解析

在厌氧氨氧化反应过程中，氮和氧同时参与反应，随着环境因素的变化，同位素丰度会呈现差异性，随着反应地进行，底物和产物含量发生改变，同时也促进了同位素的迁移转化，通过动力学模型实现反应过程机理探究及氮素循环解析。同位素分析常常采用传统的delta(δ) notion进行样品轻重同位素分析：δ15N vs air {δ15N=([15N/14N]sample/[15N/14N]air-1)×1 000，其中15R =15N/14N，空气是标准大气N2}[5，22]和δ18O vs VSMOW{δ18O=([18O/16O]sample/[18O/16O]VSMOW-1)×1 000，其中18R=18O/16O，VSMOW是指标准的维也纳标准海洋平均水含量}[23-24]。在此基础上还有稍有不同的表达方式[25-26]：

δ15N={[15N/(15N+14N)sample]/

[15N/(15N+14N)standard]-1}×1 000 (2)

δ18O={[18O /(18O+16O)sample]/

[18O /(18O+16O)standard]-1}×1 000 (3)

通过对比发现两种计算模式仅相差0.25%，两种定义方式可以看作是等价的。

反应过程中同位素的分馏效应随着反应的进行呈现差异性变化，而反应底物是否不断补给或不同来源的混合同样也会引起分馏效应的变化，常常被分为封闭系统和开放性系统。

1.2.1 封闭性系统分析 封闭系统方法是一次性投加，之后不与环境进行物质交换的孤立系统，即不发生气体损失，不进行含氮物质的交换及损失，这种封闭系统中分析同位素分馏过程的方法是由Mariotti等[27]分析所得：

αp/s=Rpi/Rs=(d15Ns/15Ns)/(d14Ns/14Ns)

(4)

αp/sln(14Ns/14Ns，0)= ln(15Ns/15Ns，0)

(5)

其中，Rpi，Rs表示产物和剩余底物同位素比率，αp/s表示同位素分馏因子，14Ns/14Ns，0表示反应过程中和起始轻同位素比值，15Ns/15Ns，0表示反应过程中和起始重同位素比值。同时可以得出f=Ns/Ns，0≈14Ns/14Ns，0，由于在自然系统中，15N丰度在0.366 3原子百分比(0.366 3± 0.018 3)附近变化很小，所以14N≈15N+14N的近似是有效的，由此推导出经典“瑞利”方程：

δs-δs，0=εlnf

(6)

δp=δs，0-ε×flnf/(1-f)

(7)

1.2.2 开放性系统分析 开放性系统即在反应过程中不断添加底物，充分满足微生物的底物要求，形成恒定同位素组成反应底物池，少量的底物会随着反应产物一同流出反应器来进行同位素比值数据的分析[28]，保证充足的底物浓度，进行非底物限制的培养。公式计算如下所示：

f×Rs+(1-f)Rp=Rs，0

(8)

Rp=Rs，0(1-fαp/s)/(1-f)

(9)

δs≈δs，0-ε(1-f)

(10)

δp≈δs，0+f×ε

(11)

2 同位素解析厌氧氨氧化机理

新型厌氧氨氧化工艺作为现阶段污水处理脱氮主要的贡献者，由于其独特的优势已经从测流转为主流工艺的应用，组合工艺能够实现长期稳定运行厌氧氨氧化成为主要的贡献者，可以弥补实际水厂碳源不足、基建费用高、污泥产量大等弊端，促进厌氧氨氧化长期稳定运行，了解反应机理成为关键。在底物氨氮和亚硝转化过程中，不仅转化为氮气，同时还有硝氮的生成，这就促进了氮和氧元素直接参与反应体系，了解反应过程中氮和氧同位素分馏效应对于同位素解析反应过程起到关键作用。结合硝化阶段N和O双同位素分析方法，了解厌氧氨氧化菌反应机理及N和O同位素效应分析见图4。

图4 厌氧氨氧化过程中同位素效应Fig.4 Isotope effect in anammox processA.氮同位素效应；B.氧同位素效应

现阶段关于分析厌氧氨氧化在反应过程中同位素迁移转化引起的同位素效应研究相对较少，对厌氧氨氧化同位素参数进行整理收集见表2。

表2 厌氧氨氧化同位素参数Table 2 The isotopic parameters of anammox

同时有研究也发现，由于氨氧化菌属分布较广，不同菌属在系统发育上存在差异，可能具有不同的酶(如亚硝酸盐还原酶)，其代谢途径也不同，从而诱导的同位素效应存在差异，对于N同位素效应呈现：15εNH+4→N2维持在(30.9±0.2)‰～(32.7±0.7)‰，15εNO-2→N2不同菌之间差值较明显，Ca.S.japonica和Ca.K.stuttgartiensis相对较接近分别为(19.9±1.7)‰和(16.0±4.5)‰[35]，而对于15εNO-2→NO-3表现出强烈的逆动力学同位素效应(15εNO-2→NO-3<0)[36]，也会存在亚硝和硝氮之间氮同位素交替或置换过程(如图4)，通常将同位素变化过程和硝化或反硝化结合起来进行分析，了解反应过程的差异性。动力学模型结合同位素测定数据才能更好地了解反应过程中参数变化，对于厌氧氨氧化底物和产物转化过程中，其分析过程如下所示。

铵同位素分馏进行数据分析常采用的计算公式：

-ln(R15NNH+4)=15εNH+4→N2×ln(fNH+4)

(12)

ln(R15NNH+4)=ln[(δ15NNH+4(t)+1 000‰)/

(δ15NNH+4(t0)+1 000‰)] (13)

ln(fNH+4)=ln[NNH+4(t)/NNH+4(t0)]

(14)

NOX同位素分馏：

(15)

(16)

δN2(t+Δt)×N2(t+Δt)=δN2(t)×N2(t)+

(17)

其中，N2(t)和N2(t+Δt) 表示t和t+Δt时刻N2浓度，δN2(t)和δN2(t+Δt)表示t和t+Δt时刻N2同位素比值。在厌氧氨氧化氮素转化过程中，氮素的转化促进了同位素动力学参数的变化，并结合上述公式进行分馏效应分析。

3 结论及展望

厌氧氨氧化作为新型主流脱氮工艺已成功应用于废水处理，充分了解氮素转化机理及反应体系实际参与反应的物质对于指导工艺运行起到至关重要的作用。在已有方法的基础上总结氮素转化方式，化学转化成为水体研究厌氧氨氧化脱氮性能氮素转化过程最可靠的方式，结合动力学模型了解厌氧氨氧化氮和氧同位素效应。N和O双同位素技术可以明确厌氧氨氧化主流工艺过程中参与反应的电子供体及实际参与反应的物质，了解脱氮过程动力学和热力学效应，实现脱氮过程元素迁移转化的定量及定性分析，但仅依靠同位素分析是不完善的，建议今后的研究领域如下：

(1)在城市污水处理中，常常同时存在多个反应共同作用，硝化、反硝化、厌氧氨氧化或自养/异养反硝化共存等，反应体系中产物由多个反应共同参与，使得系统复杂多变，那么将数学模型的研究可能成为解决负荷系统的有效途径。

(2)微生物多样性决定了总氮损失路径的多样性，特殊功能菌共同作用形成了不同的脱氮途径。但在实际工艺中，由于进水基质的复杂性和多数脱氮功能微生物的不可分离培养特性，缺少原位水平的活性细菌群落的调查。基于DNA的稳定同位素探针技术(DNA-SIP)是一种原位连接活性微生物群落和特殊生态功能的有力工具，建议采用探针技术同步进行微生物群落结构分析。

(3)N和P是城市污水处理过程主要的对象，常常将脱氮作为主方向，化学法除磷的采用使得P的迁移变化常常被忽略，同时进行N和P的同步分析可能能够更好地分析污染物的去除关系。