聚合物纳米粒子对毒素蛋白的抑制性能研究

高胜，李晓晓，鲁希华

(东华大学 化学化工与生物工程学院，上海 201620)

贫困地区的蛇咬伤问题一直难以攻克[1-2]。目前只能通过注射抗蛇毒血清治疗[3]，但是抗蛇毒血清生产成本高，周期长，且不易携带，在贫困地区施用困难[4-5]。因此需要一种廉价且有效的替代药物。无毒共聚物纳米粒子作为替代治疗方案，逐渐显示出优势[6-7]。通过在聚合物中掺入具有与靶标大分子互补官能团的单体，其可以与毒素蛋白大分子的多个表面位点相互作用，从而有效抑制靶标的毒性[8-9]。且该纳米粒子成本低，易合成，方便携带[10-11]。本文以尖吻蝮蛇毒蛋白为实验对象，合成了多种含有不同官能团的聚合物纳米粒子，以筛选出对其具有良好抑制作用的粒子。为今后毒素蛋白的抑制研究提供理论依据。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酸、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠、过硫酸铵(APS)、N-叔丁基丙烯酰胺、N-苯基丙烯酰胺、N-环己基丙烯酰胺、N-(4-(三氟甲基)苄基)丙烯酰胺、N-苯乙基丙烯酰胺、N-丙烯酰基苯丙氨酸、磷酸缓冲液、酪蛋白、血清、氢氧化钠、考马斯亮蓝R250和分子量Mark、尖吻蝮蛇毒液干粉末均为分析纯。

BI-200SM型动态光散射仪；JEM-2100型透射电子显微镜；UV-1800型紫外分光光度计；164-5050型基础电泳仪。

1.2 纳米凝胶的制备

采用乳液聚合法制备纳米凝胶NPs。将单体、交联剂和乳化剂在超纯水中混合至最终摩尔浓度为65 mmol/L，在氮气保护下搅拌60 min脱气。加入引发剂APS，并加热至70 ℃反应4 h。将反应混合物暴露于空气中，终止聚合。将反应混合物转移至透析袋中透析，除去反应原料和乳化剂等[12]。

图1 NPs合成示意图Fig.1 The synthesis of the NPs

1.3 蛋白酶抑制实验

将纳米凝胶浓缩，配制成5 mL凝胶溶液，加入1 mL粗蛇毒液，在37 ℃下温育15 min。加入1%酪蛋白，在37 ℃下孵育24 h。添加750 μL 5%的三氯乙酸，以沉淀未被蛇毒水解的酪蛋白。在25 ℃下以5 000 r/min离心10 min。将上清液与NaOH(1∶1体积)混合，在340 nm处测量UV吸光度(A样品)。实验平行进行3次。蛇毒抑制率0%和100%对照组的紫外数值分别为A空白和A对照。

抑制率(%)=[1-(A样品-A空白)/(A对照-A空白)]×100%

1.4 纳米凝胶的吸附选择

取等体积纳米凝胶与蛇毒在37 ℃下孵育 60 min。以10 000 r/min离心10 min。取出所有上清液，并连续4次用新鲜的磷酸盐缓冲液替换上清液，直到上清液中的蛋白质耗尽为止。纳米颗粒沉淀中添加10 μL的2X加载染料和10 μL缓冲溶液进行染色。同样，向纯蛇毒中加入10 μL 2X染料和10 μL缓冲液进行染色。将染色的样品在95 ℃下加热10 min，以5 000 r/min离心5 min。通过SDS-PAGE进行电泳实验，并对完成的凝胶拍照，以进行进一步的后续分析。

1.5 纳米凝胶生物相容性实验

将人体纤维细胞离心分散于PBS中，并以每孔20 000个细胞接种在96孔板中。加入150 μL培养基，在37 ℃，5%CO2培养箱中孵育30 min。离心沉淀，除去上清液，并用100 μL新鲜培养基代替。加入MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)，在37 ℃，5%CO2培养箱中温育4 h。离心，将所有培养基替换为DMSO。在37 ℃温育 20 min，通过酶标仪在570 nm处测定吸光度[13]。

2 结果与讨论

2.1 纳米凝胶的合成

NPs与蛋白质之间的相互作用非常复杂，涉及静电作用、氢键作用、空间位阻和疏水作用等多种相互作用[14]。对于大多数NPs，它们与靶蛋白的相互作用与NPs中的单体结构密切相关[15]。通过乳液聚合法合成并组建了一个丙烯酰胺基聚合物NPs库，见表1。

表1 具有不同功能性单体的凝胶库Table 1 Summary of NPs with various functional groups

使用单体包括N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)、丙烯酸(AA)、N，N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)、N-叔丁基丙烯酰胺(TBA)、N-苯基丙烯酰胺(PAA)、N-环己基丙烯酰胺(HAA)、N-(4-(三氟甲基)苄基)丙烯酰胺(3FPAA)、N-苯乙基丙烯酰胺(PEAA)、N-丙烯酰基苯丙氨酸(Aphe)，都含有不同的功能性官能团(图2)。这些单体对某些蛋白质具有极好的亲和力[9，16-17]。

图2 不同单体结构示意图Fig.2 Monomers of the NP library

2.2 纳米凝胶的表征

将透析纯化好的共聚纳米水凝胶用超纯水稀释后，使用动态光散射仪(DLS)观察其尺寸和分散性，结果见表2。

表2 纳米水凝胶的粒径及分散性Table 2 Diameter and PDI of NPs with variousfunctional groups

由表2可知，所有NPs均显示出良好的分散性(PDI <0.1)，平均动力学直径为80～100 nm。

使用透射电子显微镜(TEM)观察纳米凝胶的形貌，以 NP 1-3 为例，结果见图3。

由图3可知，合成的纳米水凝胶呈球形，分散良好。

图3 NP 1-3纳米凝胶的TEM形貌图Fig.3 TEM image of NP 1-3

2.3 纳米凝胶的筛选

将NPs与蛇毒混合后,再与偶氮酪蛋白混合，测定NPs(6 mg/mL)对蛇毒(0.25 mg/mL)的抑制作用。该方法是定量分析和研究蛇毒抑制作用的最有效方法(图4)，蛇毒中的蛋白水解酶通过破坏底物酪蛋白酶的肽键，使其裂解，并将其片段化为氨基酸，释放的氨基酸可以被定量测定，并且蛇毒中的蛋白酶活性越高，分解的底物酪蛋白酶就越多。因此，可以使用定量分光光度法测定凝胶对蛇毒的抑制率，结果见图5。

图4 蛋白酶实验测定步骤示意图Fig.4 Protease assay used to analyze inhibition of enzymatic hydrolysis of Agkistrodon acutu to casein

图5 不同NPs对尖吻蝮蛇毒的抑制实验Fig.5 Inhibition of Agkistrodon acutu venom by NPswith various functional groups

由图5可知，带有Aphe的NP 1-7对蛇毒的抑制作用高达80%，远高出其他NPs对蛇毒的抑制作用，单体Aphe的存在使得NPs对蛇毒的吸附抑制具有良好的正效应。另外，NP 1-2 与NP 1-1相比，含有阴离子基团的NP 1-2抑制率更高，验证了聚合物中阴离子存在的必要性；NP 1-2、 NP 1-3、 NP 1-4中含有单体的疏水性依次增大，三者对蛇毒的抑制作用也逐次增加，说明NPs保持一定的疏水性更有利于NPs-蛋白的吸附；NP 1-5和NP 1-6中含有的PEAA和3FPAA比NP 1-4的PAA分别多了一个乙基和碳氟基团，但是两者的蛇毒抑制率却小于 NP 1-4，结构中多含有的基团对蛇毒的抑制并没有促进作用；最后，NP 1-5与NP 1-7含有完全相同的官能团，但是两者对蛇毒的抑制作用却分别为20%和80%，差别很大，说明NPs与生物大分子相互作用时，正确的空间效应也不可忽视。综上可知，凝胶NP 1-7对尖吻蝮蛇毒的抑制作用最好。

2.4 NP 1-7的蛋白吸附实验

使用SDS-PAGE观察尖吻蛇毒在NP 1-7上的亲和吸附情况，在反复清洗和过滤毒液与NP 1-7的亲和复合物后，对复合物进行了电泳实验，结果见图6。NPs吸附的蛇毒蛋白显示在吸附蛋白条带中，在吸附条带中有多个纯蛇毒蛋白对应的条带(方框处)，证明了NP 1-7对蛇毒的吸附作用。

图6 NP 1-7对尖吻蝮蛇毒的吸附电泳实验Fig.6 SDS-PAGE visualization of venom andstrongly bound proteins by NP 1-7

2.5 血清存在下NPs对蛇毒的抑制率

NPs在体内的功效会受到NPs与血清中其他生物大分子非特异性相互作用的影响[18]。基于 NIPAm 的纳米材料可以在体内迅速的吸附其他生物蛋白，获得蛋白质电晕，初始冠状成分的很大一部分由高度丰富的血清蛋白质白蛋白组成。为了确定血清和NPs之间的相互作用是否会阻碍凝胶对毒液蛋白的中和，在血清存在的环境中进行NPs对蛇毒的抑制实验。将血清和NP 1-7孵育后，再与蛇毒进行孵育，结果见图7。

图7 在不同的血清中NP 1-7(6 mg/mL)对蛇毒(0.25 mg/mL)的抑制作用Fig.7 Inhibition of venom (0.25 mg/mL) by NP 1-7(6 mg/mL) in variable serum

由图7可知，血清与NP 1-7之间的相互作用对NPs的蛇毒中和作用产生了影响，与不存在血清相比，随着体系中血清浓度的逐步增大，NP 1-7对蛇毒抑制作用从80%逐步降低到20%；但是在较低浓度血清下(<40 mg/mL)，NP 1-7对蛇毒的抑制作用在50%左右，仍然可观，此时体系中的血清蛇毒含量比已经高达160∶1。

2.6 血清存在下的吸附电泳实验

同样在血清存在的环境下，使用SDS-PAGE电泳实验观察NP 1-7对蛇毒的吸附情况，结果见图8。左边两个条带分别为对照蛇毒条带和血清条带，凝胶吸附条带为血清存在下NP 1-7对蛇毒的吸附情况。

图8 血清和蛇毒同时存在下的NP 1-7吸附实验图Fig.8 NP 1-7 incubated in serum and venom fromAgkistrodon acutus venom

由图8可知，在血清存在的环境下，NP 1-7吸附条带上同样可以看到纯蛇毒所对应的条带(方框处)，这说明该凝胶在血清和蛇毒同时存在的情况下，对蛇毒蛋白仍具有一定的吸附作用。也证明了本实验中血清存在下的蛇毒抑制实验结果。

2.7 细胞活性实验

为了评估NPs的安全性和生物相容性，使用MTT法确定与NP 1-7共同培养后人体纤维细胞的存活率，结果见图9。

图9 细胞在不同浓度NP 1-7中的存活率Fig.9 Survival of cells after incubation withdifferent concentrations of NP 1-7

由图9可知，将不同浓度的凝胶NP 1-7(125～1 000 μg/mL)与细胞共同培养24 h，细胞的存活率均可达到95%以上。说明NP 1-7具有良好的安全和生物相容性，有望在将来应用于生物医学或组织工程领域。

3 结论

(1)设计合成并组建了基于NIPAm的共聚物凝胶纳米粒子库，筛选对尖吻蝮蛇毒有抑制作用的粒子。DLS和TEM显示，合成的多种纳米凝胶分散性良好(PDI<0.1)；蛋白酶实验发现，含有Aphe单体的纳米粒子NP 1-7对尖吻蝮蛇毒具有较好的抑制作用，抑制率高达80%。

(2)SDS-PAGE电泳实验证明了NP 1-7对蛇毒的吸附作用，即使在血清存在的环境下，凝胶poly(NIPAm-Aphe)对蛇毒仍然具有50%左右的吸附抑制作用。

(3)细胞实验证明NP 1-7纳米凝胶粒子无明显毒性，细胞的存活率均可以达到95%以上，进一步优化的poly(NIPAm-Aphe)纳米凝胶粒子有望应用于人工合成抗体。