葛根定眩胶囊中黄曲霉毒素G2，G1，B2，B1 含量测定及安全性评价

2021-12-15徐小龙陈乃江

中国药业 2021年23期

徐小龙，刘颖，陈乃江

（1. 南京中医药大学连云港附属医院·江苏省连云港市中医院，江苏连云港 222006； 2. 江苏省连云港市食品药品检验检测中心，江苏连云港 222006）

葛根定眩胶囊由葛根、桂枝、生白芍、炙甘草、僵蚕、羌活、川芎、钩藤、生姜9 味中药组方，其主要功效为解肌和营、疏风定眩，主治太阳经枢不利所致颈项强痛、头痛、头晕目眩等症状。该制剂中含有僵蚕，2020 年版《中国药典（一部）》中收载的相关药材均涉及黄曲霉毒素（AF）的检测。AF 属呋喃香豆素的多环结构化合物，主要由黄曲霉和寄生曲霉次级代谢产生［1－2］，AFB1，AFB2，AFG1，AFG2，AFM1，AFM2是 AF 最常见的有毒衍生物，其中毒性最强的是 AFB1［3］。目前，检测 AF 的方法有液相色谱－质谱联用法［4－6］、荧光分光光度法、高效液相色谱法、免疫层析法、酶联免疫吸附法、高效液相色谱（HPLC）－柱后光化学衍生法等［7－15］。其中 HPLC －柱后光化学衍生法简便快捷，且AFB1和AFG1经紫外线照射即具有荧光性［7］，应用HPLC 荧光检测器就可完成检测。本研究中建立了测定葛根定眩胶囊中AF 有毒衍生物 AFB1，AFB2，AFG1，AFG2含量的 HPLC －柱后光化学衍生法，并评价其安全性，为提高其质量标准提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司），配有 Waters 2695－2475 型荧光检测器，Empower 3 型色谱工作站；KQ－500TDB 型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司，功率为500 W，频率为80 kHz）；AE－100 型电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度为0.000 1 g）；AF 免疫亲和柱（青岛普瑞邦生物工程有限公司，批号为171117）。

1.2 试药

葛根定眩胶囊（江苏省连云港市中医院院内制剂，批号分别为 20201208，20210618，20210619，20210620）；AFB1，AFB2，AFG1，AFG2混合对照品溶液（中国食品药品检定研究院，批号为610001－202006，标示浓度依次为 1.04，0.38，1.08，0.38 μg ／mL）；甲醇、乙腈（色谱纯，德国默克公司）；磷酸、氯化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：Phenomenex C18Gemini 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇－乙腈－水（40 ∶18 ∶42，V ／ V ／ V）；流速：1.0 mL ／min；柱温：25 ℃；检测器：荧光检测器；激发波长：365 nm；发射波长：450 nm；进样量：10 μL。在此色谱条件下，相邻色谱峰的分离度大于1.5，阴性对照无干扰。色谱图见图1。

图1 系统适用性试验高效液相色谱图1.AFG2 2.AFG1 3.AFB2 4.AFB1A.Mixed standard solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms of the system suitability test

2.2 溶液制备

精密量取 AFB1，AFB2，AFG1，AFG2混合对照品溶液0.5 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为混合标准品贮备液。精密量取混合标准品贮备液1 mL，置25 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得AF 混合标准品溶液。取样品，倾出内容物，研细，取15 g，精密称定，置匀质瓶中，加氯化钠3 g，精密加入70%甲醇溶液75 mL，高速搅拌 2 min，离心（转速为 12 000 r／min）5 min，精密量取上清液15 mL，置50 mL 容量瓶中，加水稀释并定容，摇匀，离心（12 000 r／min）10 min，取上清液 20 mL，过AF 免疫亲合柱，加水20 mL 洗脱，弃洗脱液，使空气入柱，将水挤出，加适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2 mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。以甲醇为阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察、检测限及定量限确定：精密吸取2.2 项下 AF 混合标准品溶液 5，10，15，20，25 μL，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以进样量（X，pg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，结果见表1。精密量取2.2 项下AF 混合标准品贮备液，以甲醇逐级稀释，按2.1 项下色谱条件进样测定，以信噪比（S ／ N）为 3 时的响应强度浓度为检测限，以 S ／ N 为10 时的响应强度浓度为定量限。结果见表1。

精密度试验：取2.2 项下混合标准品溶液适量，按2.1 项下色谱条件连续进样测定7 次，记录峰面积。结果见表1，表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为20210619）样品2 g，精密称定，共6 份，精密量取2.2 项下混合标准品溶液0.4 mL，依法制备供试品溶液，按 2.1 项下色谱条件进样测定2 次，记录峰面积。结果见表1，表明方法重复性良好。

稳定性试验：取2.2 项下供试品溶液适量，分别于室温下放置 0，1，2，4，8，12 h 时进样测定，并记录峰面积。结果见表1，表明供试品溶液在12 h 内稳定。

表1 方法学考察结果Tab.1 Results of the methodological investigation

加样回收试验：取不含AF 的阴性样品，倾出内容物，研细，取15 g，精密称定，置匀质瓶中，加氯化钠3 g，精密加入70%甲醇75 mL，搅拌2 min，离心（转速为12 000 r／min）5 min，精密量取上清液 15 mL，置 50 mL容量瓶中，分别精密加入混合标准品溶液1，2，3 mL，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，并计算含量。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n ＝9）Tab.2 Results of the recovery test（n ＝ 9）

2.4 样品含量测定

取样品（批号分别为 20201208，20210618，20200619，20210620）适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量，结果见表 3。2020 年版《中国药典（一部）》规定，AFB1和AFB1，AFB2，AFG1，AFG2总量的最高限量分别为 5 μg／kg和10 μg／kg，故4 批样品AF 残留量测定结果均符合药典规定。

表3 样品含量测定结果（μg／kg）Tab.3 Results of content determination of AF in the samples（μg ／kg）

3 讨论

3.1 检测方法选择

中药材和食品中AF 检测方法主要有薄层层析法、液相色谱法、酶联免疫吸附法、金标免疫层析检测技术、质谱法等。葛根定眩胶囊由9 味药材组方，成分复杂，其中僵蚕属昆虫类药物，生物活性蛋白成分多，用常规的薄层层析法及酶联免疫吸附法做定性检测，专属性不强。HPLC－柱后光化学衍生法可定量快速检测；另外，商品化的免疫亲合柱多，获取方便，方法简单，易验证和确认，用于检测葛根定眩胶囊中AF 有毒衍生物的含量，灵敏度高，特异性强，快捷准确。

3.2 流动相和检测波长选择

AF 为极性化合物，流动相以水为基础溶剂。曾考察乙腈－水（55 ∶45，V ／ V）和甲醇－水（70 ∶30，V ／ V）2 种流动相对色谱分离效果的影响，均能有效洗脱和检测AF，但以甲醇－乙腈－水（40 ∶18 ∶42，V ／ V ／ V）为流动相时AFB1，AFB2，AFG1，AFG24 个成分均能做到基线分离，色谱峰峰形尖锐、对称。以流动相为背景溶液，以荧光检测器在190 ～600 nm 波长范围内测定混合标准品溶液，结果AFB1，AFB2，AFG1，AFG2最佳激发波长为 360 nm，AFG1和AFG2在 450 nm 波长附近有最大吸收，AFB1和 AFB2在430 nm 波长附近有最大吸收，最终选择激发波长为360nm，发射波长为 450nm。AFB2和 AFG2荧光吸收较弱，借助紫外衍生器（254 nm）荧光吸收强度可提升10 倍以上。

3.3 方法操作要点

AF 性质相对稳定，标准品溶液和供试品溶液在2.1 项下色谱条件的响应稳定可靠，且考虑样品前处理净化、富集是影响测定结果的主要因素，必要时可进行加样回收试验。对于多数阴性样品或远低于限度的极弱阳性样品，不必追究其真实含量和检测精密度；对于远超限度的强阳性样品，可采用外标一点法予以定量控制。

3.4 安全性评价

AF 是一种剧毒物质，已被癌症研究机构划为一类致癌物，适宜生长和产毒的条件为10 ～45 ℃，最适温度为30 ℃，相对湿度为85%，要求药品在存储、运输过程中要注意控制温度和相对湿度。需进行AF 检测的中药材品种包括15 个种子果实类中药材（马钱子、使君子、大枣、豆蔻等），2 个根和根茎类中药材（远志、延胡索），8 个动物类中药材（水蛭、地龙、全蝎、蜈蚣、僵蚕、蜂房、九香虫、土鳖虫）［16］。本研究中仅 1 个批次样品检出AF 有毒衍生物，其含量为 AFB11.39 μg ／ kg，AFB20.13 μg ／kg，AFG20.10 μg ／kg，其他 3 个批次均未检出。2020 年版《中国药典（一部）》规定，AFB1的最大限量为 5 μg ／ kg，AFB1，AFB2，AFG1，AFG2总量不超过10 μg／kg，符合药典规定，可为以僵蚕生药粉为原料的中成药检查AF 提供参考。