罗非鱼湖病毒S10 基因编码蛋白的表达及单克隆抗体的制备

王雅慧，王英英，王 庆，李 波，李莹莹，尹纪元，杨 广，曾伟伟

（1.天津农学院水产学院，天津 300384；2.中国水产科学研究院珠江水产研究所/农业农村部渔药创制重点实验室/广东省水产动物免疫技术重点实验室，广东 广州 510385；3.佛山科学技术学院生命科学与工程学院/广东省动物分子设计与精准育种重点实验室/普通高校动物分子设计与精准育种重点实验室，广东 佛山 440605）

【研究意义】罗非鱼因生长快、食性杂、病害少、肉质好、产量高等优点，已被引入中国、印度尼西亚和埃及等90 多个国家并被广泛养殖。预计2021 年全球罗非鱼产量将达到729 万t，为仅次于鲤科鱼类的全球第二大养殖鱼类［1］。中国是罗非鱼的主要养殖和生产基地，养殖量约占全球30%［2］。罗非鱼具有较强的抗病性和抗逆性，适合集约化养殖系统，是一种廉价的蛋白质来源。但近年来罗非鱼病害频生，给全球罗非鱼养殖产业造成了巨大的经济损失，严重制约罗非鱼产业的可持续发展。其中，自2009 年开始，在以色列、厄瓜多尔、埃及、泰国、印度等多国相继暴发的一种新发疫病——罗非鱼湖病毒病（Tilapia Lake Virus Disease，TiLVD），给全球罗非鱼养殖业带来巨大威胁和严峻挑战［3］。该病病原为一种新型RNA 病毒——罗非鱼湖病毒（Tilapia Lake Virus，TiLV）。目前，对于 TiLV 致病机制、TiLV 基因组中各节段基因功能均不清楚，对TiLVD 尚无有效的防控措施。因此，针对TiLV 的单抗抗体制备对于TiLV 病原学研究及TiLVD 防控均具有重要意义。

【前人研究进展】TiLV 是一种包膜病毒［4-5］，其基因组由10 个单股负链RNA 片段组成，共编码14 个功能蛋白［6-7］。目前，国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICVT）将TiLV 作为一个新种，单独列为罗非鱼湖病毒属、罗非鱼病毒新科［8］。Til-4-2011 是第一个完成全基因组测序的TiLV 分离株［3］，其S1节段包含1 个与正粘病毒科C 型流感病毒（ICV）PB1 亚基具有序列同源性的开放读码框，最初将TiLV 确定为一种新型正粘病毒样病毒［5］。后续研究表明，S1、S2、S4 和S5 节段与Dhori 病毒有很强的同源性，S6、S7 和S8 与流感病毒进化上接近，而S3 节段与传染性鲑鱼贫血病毒有较弱的同源性［6］。TiLV 各基因节段编码的蛋白功能均未知。生物信息学分析和预测表明，TiLV S10 基因节段编码的蛋白含有一个溴结构域。溴结构域是一类保守的蛋白质结构域，能特异性识别乙酰化赖氨酸并形成驱动活性转录的蛋白质复合物，从而调节基因转录［9］。相比于其他9 种蛋白，TiLV S10 编码蛋白具有更丰富的抗原表位［10］，提示S10 编码蛋白具有更强的免疫原性。

【本研究切入点】罗非鱼对TiLV 高度敏感，在各个养殖阶段都能受TiLV 感染，以早期发育阶段的发病率和死亡率相对更高，死亡率在20%～90%之间［11］。水平传播是罗湖病毒重要的传播途径之一［4］，健康鱼可通过受TiLV 污染的水和设备感染TiLV［12］。感染鱼的肠道中和粪便中均可检测到TiLV 基因组RNA，表明极有可能存在粪口传播途径。近年来的研究表明，在2 日龄鱼苗中检测到TiLV，在病鱼生殖器官中也能检出TiLV 基因组RNA 和活病毒，表明TiLV 可能存在垂直传播途径［13］。迄今为止，针对TiLV 的感染尚无有效的防治办法。加强TiLV 病原学基础研究、开发高效的疫苗和有效的防治药物是当前TiLVD 防控研究的热点和重点。

【拟解决的关键问题】TiLV 基因组S10 基因节段编码的蛋白具有较强的免疫原性和重要的生物学功能。本研究利用原核表达系统获得S10 重组蛋白，并将纯化的重组蛋白免疫小鼠，经融合和筛选获得阳性杂交瘤细胞株，然后制备抗S10蛋白的MAb，并对MAb 的生物学特性进行鉴定，为后续深入研究S10 蛋白的功能、TiLV 病原学以及疫苗和药物的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

pET-32a（+）载体、小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）均为中国水产科学研究院珠江水产研究所病害防控与免疫实验室保存；用于增殖TiLV 的TiB细胞系由该实验室建立并保存［14］，Escherichia coliDH5α 和E.coliBL21 感受态细胞购自北京康为世纪生物科技有限公司，6 周龄SPF 雌性BALB/c 小鼠购自广东省实验动物中心，异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗兔IgG、FITC 标记的羊抗鼠IgG、HRP 标记羊抗鼠IgG、HT、HAT、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂和PEG3350 均购自Sigma-aldrich西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，RPMI-1640 培养基、胎牛血清、DMEM-20 完全培养基、蛋白质Marker、RIPA 裂解液、限制性核酸内切酶（BamH Ⅰ和Hind Ⅲ）和 T4 DNA 连接酶购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，MiniBEST DNA Fragment Purification Kit、Prime STAR Max DNA Polymerase 购自宝生物工程（大连）有限公司，质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒均购自广州飞扬生物工程有限公司，SDS-PAGE 试剂盒、超敏化学发光显色液购自新赛美生物科技有限公司，小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 重组表达质粒pET32a-S10 的构建 根据TiLV S10 全长基因序列（GenBank 登录号：KU751823.1）设 计PCR 引 物，S10-F 序 列：5'GCT GGA TCC ATG AGT GTG GCA GAT TAT 3'（下划线为BamH Ⅰ酶切位点），S10-R 序列：5' GCG AAG CTT ACG TCA AGA GAC TTC TTC C 3'（下划线为HindⅢ酶切位点）。以中国水产科学研究院珠江水产研究所病害防控与免疫实验室保存的TiLV cDNA 为模板，使用引物组S10 F/R 扩增目的基因片段，PCR 反应程序为 95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共35 个循环；72 ℃后延伸10 min。PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶回收后与pET32a 载体分别用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ限制性内切酶在37 ℃下双酶切20 min，然后分别进行纯化回收。回收产物按比例配置好连接体系后，在T4 DNA 连接酶作用下22 ℃连接20 min，然后转化E.coliDH5α感受态细胞。挑取单菌落进行酶切验证，验证正确后送至上海生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序鉴定，鉴定正确的质粒即为pET32a-S10，扩大培养后于-20 ℃保存备用。

1.2.2 S10 重组蛋白的表达及纯化 将重组质粒pET32a-S10 转化至E.coliBL21（DE3）感受态细胞，挑取单菌落于含氨苄青霉素的LB 液体培养基中培养至菌液OD600值为0.6 左右时，添加终浓度为0.1 mmol/L 的IPTG 于28 ℃条件下诱导表达（未诱导组不加IPTG）。将诱导表达后的重组菌液于10 000 r/min、4 ℃离心8 min 收集菌体，按100 mL 裂解缓冲液（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris，5% 甘 油，1 %Triton 100，pH 值8.0）与1 L 重组菌液的体积比进行重悬，冰浴条件下以超声波破碎30 min，10 000 r/min、4 ℃离心30 min，分别收集上清及沉淀，将收集的上清用镍柱进行纯化。收集不同浓度咪唑洗脱的洗脱产物进行SDS-PAGE 检测，分析蛋白纯化效果并利用BCA 法测定目的蛋白浓度。将纯化好的S10重组蛋白分装后置于-80 ℃保存备用。

1.2.3 小鼠免疫 用纯化的S10 重组蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化完全后，皮下注射BALB/c 小鼠，每只小鼠的免疫剂量为100 μg 重组蛋白。2 周后进行第2 次免疫，取等体积的弗氏不完全佐剂与纯化的S10 重组蛋白均匀乳化后进行皮下注射，免疫剂量与第1 次免疫相同。二免后2 周和4 周分别进行第3、4 次免疫，方法和剂量与第2 次免疫相同。第4 次免疫1 周后，尾静脉采血测定抗血清效价，效价达到 1 ∶10 000以上时用100 μg S10 重组蛋白直接腹腔注射BALB/c 小鼠加强免疫。

1.2.4 杂交瘤细胞株的克隆与筛选 参照文献［15-16］建立杂交瘤细胞株的方法，细胞融合前，在无菌条件下制备小鼠脾细胞悬液。骨髓瘤细胞SP2/0 与免疫小鼠脾细胞按比例进行细胞融合。待融合细胞生长至96 孔板培养面积的1/4～1/3 时，取100 μL 细胞培养上清用间接ELISA 方法进行检测，筛选出阳性且效价较高的细胞进行克隆纯化，将可以稳定分泌抗体的杂交瘤细胞扩大培养并于液氮中长期保存。

1.2.5 MAb 纯化和亚型鉴定 将阳性的杂交瘤细胞经BALB/c 小鼠腹腔注射，待小鼠腹腔膨大时收集并纯化腹水，得到纯化的MAb，于-80 ℃保存。使用小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒对筛选后的MAb 进行鉴定，按照试剂盒说明书进行操作。结果可通过酶标仪读取450 nm 波长的OD 值或直接观察判读，OD 值最高或颜色最深孔对应的即为相应亚型。

1.2.6 间接ELISA 检测MAb 效价 在酶联板中包被抗原，4 ℃放置过夜，PBST 洗板3 次，吸水纸上拍干，用5%脱脂奶37 ℃封闭2 h，洗板，每孔加入MAb 100 μL，加盖在37 ℃孵育1～2 h，每个样品平行做2～3 份，PBS 作为阴性对照，已知样品作为阳性对照。洗板，每孔加酶标抗抗体100 μL，加盖在37 ℃孵育1 h，洗板后每孔加入辣根过氧化物酶反应的显色液100 μL，显色5 min，每孔加入 2 mol/L 硫酸终止液50 μL，终止反应。用酶标仪测定 450 nm 波长各待测孔的OD值，若样品OD 值和阴性对照OD 值之比大于 2.1（P/N ＞2.1），则结果判为阳性。

1.2.7 Western-blot 鉴定MAb 特异性 用S10 重组蛋白、感染TiLV 的TiB 细胞及未感染病毒的TiB 细胞对MAb 进行特异性分析。将S10 重组蛋白、TiLV 感染和未感染的TiB 细胞进行SDSPAGE 分析，电转印于硝酸纤维素膜（NC 膜）上，NC 膜于5%的脱脂奶粉溶液下37 ℃孵育2 h，PBST 洗涤后加入1 ∶100 稀释的MAb 4 ℃封闭过夜，PBST 洗涤，加入1 ∶1 000 稀释的羊抗鼠IgG-HRP 标记抗体，室温下温和振荡结合1 h，PBST 洗涤，加入超敏化学发光显色液避光显色，于化学发光成像系统（BIO-RAD，Gel Doc XR ＋system）观察结果。

1.2.8 IFA 鉴定MAb 特异性 在24 孔板中培养单层的TiB 细胞，TiLV 接毒96 h 后，参照文献［17］的IFA 操作步骤，结果于荧光倒置显微镜（Nikon，EclipseTi-S）下观察，阴性抗原对照为正常TiB细胞。

2 结果与分析

2.1 S10 基因的扩增及重组表达质粒的构建

以S10 基因序列为模板进行PCR 扩增，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果（图1）显示，在300～400 bp 之间可见一条特异性条带，与预期目的片段314 bp 结果相符。BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后也出现约314 bp 的条带，与预期结果相符。测序结果进一步证实扩增片段与S10 基因序列一致，说明重组质粒构建成功，并将其命名为pET32a-S10。

图1 TiLV S10 基因PCR 扩增产物及pET32a-S10 酶切鉴定结果Fig.1 PCR amplification products of TiLV S10 gene and restriction enzyme identification result of pET32a-S10

2.2 S10 重组蛋白的表达与纯化

将重组质粒pET32a -S10 转化E.coliBL21（DE3）感受态细胞内，在28 ℃条件下IPTG 诱导表达12 h 后，经SDS-PAGE 电泳，结果（图2）显示，与未诱导组相比，诱导组在40 ku 与30 ku之间有一条特异的蛋白条带，与预期的蛋白分子质量大小一致，且蛋白在上清和包涵体中均获得表达。经镍柱纯化后的目的蛋白纯度较高，条带单一无明显杂带。

图2 重组S10 蛋白表达与纯化结果Fig.2 Expression and purification results of recombinant S10 protein

2.3 MAb 筛选和亚型鉴定

将骨髓瘤细胞SP2/0 与免疫小鼠脾细胞融合后经过4 次亚克隆，利用间接ELISA 方法对上清进行检测，筛选出2 株可稳定分泌抗TiLV-S10蛋白的MAb 杂交瘤细胞株，分别命名为2C3 和2E3。用小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒对其分泌的抗体进行亚型鉴定，结果显示，2C3 抗体为IgG1/к 型，2E3 抗体为IgG2a/к 型。

2.4 MAb 效价

2C3 和2E3 腹水抗体纯化后浓度分别为1.05、1.14 mg/mL，抗体稀释200 倍后进一步倍比稀释，用间接ELISA 法测定制备的杂交瘤细胞株效价，空白对照 OD450值为0.114，结合酶联结果阳性判断标准，得出2C3 和2E3 腹水抗体效价分别为1 ∶12 800、1 ∶51 200。

2.5 Western-blot 鉴定MAb 特异性

以空载蛋白为阴性对照，S10 重组蛋白以及纯化的TiLV 经由SDS-PAGE 后转印至NC 膜上，以纯化后的2C3 和2E3 MAb 为一抗，HRP 标记的羊抗鼠IgG 为二抗。结果（图3）显示，2C3 和2E3 MAb均能与S10蛋白和纯化的TiLV发生反应，目的条带约为38 ku，与预期结果相符，表明制备的2C3 和2E3 MAb 均可特异性识别TiLV。

图3 Western blot 分析两种MAbs 的特异性结果Fig.3 Western blot analysis of the specificity of two MAbs

2.6 间接免疫荧光鉴定MAb 特异性

以制备的2C3 和2E3 MAb 作为一抗，与感染TiLV 的TiB 细胞和未感染TiLV 的TiB 细胞进行IFA 试验鉴定，结果（图4）显示，2C3 和2E3 能对病毒感染的TiB 细胞产生特异性的绿色荧光，与未感染病毒的TiB 细胞呈现阴性反应，说明制备的2C3 和2E3 两株抗S10 蛋白MAb 具有良好的特异性。

图4 IFA 反应特性鉴定（400×）Fig.4 Reactivity identification of IFA（400×）

3 讨论

TiLV 从2009 年发现至今，有关其病原学和基因功能研究鲜有报道，病毒基因组各节段基因编码蛋白的功能和特征尚未明确，对其结构蛋白与非结构蛋白之间的相互作用、病毒增殖的调控及致病机理等方面，还有待全面研究和深入探索。通过对TiLV 各蛋白的功能研究和了解，有助于更深入了解该病毒的复制过程以及病毒感染过程中的分子机制。MAb 在病毒的病原学基础研究、诊断技术和疫苗开发以及基因功能研究等方面均具有重要作用［18］。由于目前还没有针对TiLV 的防治方案，早期监控和免疫预防将成为防控该疾病的主要手段。此外，MAb 对于病毒感染具有巨大治疗潜力，具有中和活性的MAb 可以直接中和病毒，从而阻止病毒的扩散和增殖。随着MAb 技术的发展，其在治疗感染性疾病中占据不可替代的地位［19］。

溴结构域广泛存在于真核细胞中，可以识别乙酰化赖氨酸残基的一类保守蛋白结构域［9］。研究表明，许多与转录有关的转录因子以及与染色质有关的蛋白质都存在溴结构域，根据结构序列，可以把含溴结构域蛋白（BCPs）划分为八大家族，目前研究较为深入的是具有表观遗传学靶点，与多种疾病关系紧密，并在介导基因转录和调控细胞周期中发挥重要作用的第Ⅱ家族溴结构域与超末端结构域［20-21］。目前，还有许多溴结构域的功能尚未明确，在水生动物上的研究与应用更是如此。通过TiLV S10 序列分析发现，该蛋白中含有1 个溴结构域，可能与TiLV 的基因转录有关，但由于S10 蛋白相关研究较少，其潜在的结构与功能未知，针对S10 蛋白的重组表达和单抗制备可为该蛋白的功能研究和TiLV 免疫学诊断奠定基础。

本研究通过构建载体pET32a-S10，并对其进行诱导表达，SDS-PAGE 分析显示表达的蛋白大小约为38 ku。通过Western blot 分析证实该蛋白质具有良好的反应原性。以纯化的S10 重组蛋白为免疫原，制备并筛选出2 株能够稳定高效分泌抗TiLV MAb 的杂交瘤细胞株，间接ELISA 分析结果显示，2 株细胞株制备的MAb 效价分别为1 ∶12 800、1 ∶51 200。Western blot 和IFA 证实，2 种MAb 均能特异性识别S10 蛋白和TiLV。2 种MAb 均可识别TiLV 病毒S10 蛋白上的某一抗原表位，而该抗原表位的具体结构特征，则有待进一步深入探究。

4 结论

本研究成功构建了含有TiLV 基因组S10 节段的原核表达载体pET32a-S10，经IPTG 诱导可表达出大小约为38 ku 的目的重组蛋白。利用纯化的重组蛋白免疫小鼠，经多轮筛选和鉴定，最终获得2 株能够分泌抗S10 编码蛋白MAb 的杂交瘤细胞株，其编号分别为2C3、2E3。其中2C3细胞株分泌的抗体为IgG1/к 型，2E3 分泌的抗体为 IgG2a/к 型，2 株细胞株经注射小鼠制备的MAb 效价分别为1 ∶12 800 和1 ∶51 200。经Western blot 和IFA 分析证实，2 种MAb 均能与TiLV 特异性反应。本研究制备的MAb 特异性好，抗体效价高，可为后续TiLV S10 蛋白结构功能研究、TiLV 疫苗研发、治疗手段以及诊断试剂的开发提供重要基础材料。