高效液相色谱法同时测定小儿消积通便颗粒中5-羟甲基糠醛等9种有效成分的含量

马国平，周洪亮，范智毅，赵霞，刘志辉作者单位：南京中医药大学附属医院药学部，江苏 南京009；南京中医药大学药学院，江苏 南京 003

儿童功能性便秘是由多种因素引起的以粪便硬结、持续排便困难、排便次数减少等为主要症状的功能性肠胃疾病，是儿童最常见的消化道功能紊乱疾病之一。小儿消积通便方为江苏省中医院赵霞主任根据小儿的生理病理特点及儿童功能性便秘的病因病机自拟的临床经验方，本方由炒枳实、姜厚朴、炒白术、火麻仁、炒决明子、炒鸡内金、焦山楂、连翘和胡黄连组成。其中，炒枳实消食导滞为君，姜厚朴理气除满为臣，佐以炒白术健脾和胃，火麻仁、决明子润肠通便，炒鸡内金、焦山楂健胃消食，连翘清热散结，胡黄连燥湿消积，共奏消食化积，润肠通便之功，主要用于小儿食积便秘的干预和治疗，临床应用十数年，疗效显著。

本研究采用高效液相色谱法（HPLC）对小儿消积通便颗粒中5-羟甲基糠醛、连翘苷、连翘酯苷A、胡黄连Ⅰ、胡黄连Ⅱ、柚皮苷、橙皮苷、橙黄决明素、厚朴酚的含量进行研究，为其质量标准的制订提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪（主机：1100 型，检测器：G1314A 型紫外检测器，美国Aglient 科技有限公司）；Sartorius BP-211D 电子分析天平（赛多利斯公司）；SK6200H 超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；Milli-Q纯水仪（密理博科技有限公司）。

1.2 试药

小儿消积通便颗粒由江苏省中医院生产（批号190220，190221，190222）；橙黄决明素（纯度≥89.9%，批号111900-201303，中国食品药品检定研究院）；5-羟甲基糠醛（批号160512），连翘酯苷A（批号181110），胡黄连苷Ⅱ（批号181107），柚皮苷（批号181119），橙皮苷（批号181106），胡黄连苷Ⅰ（批号180602），连翘苷（批号190103），厚朴酚（批号181105）均购自南京聚康医药化工有限公司，纯度≥98%；阴性制剂（除不加各组方药材外，制备方法同小儿消积通便颗粒）由实验室制备；乙腈（色谱纯，美国TEDIA有限公司），超纯水（自制）。

2 方法与结果

2.1 对照品、供试品及阴性溶液的制备

精密称取对照品适量，加甲醇制成每毫升分别含5-羟甲基糠醛、连翘苷、连翘酯苷A、胡黄连苷Ⅰ、胡黄连苷Ⅱ、柚皮苷、橙皮苷、橙黄决明素、厚朴酚190.00 μg、46.55 μg、108.70 μg、26.18 μg、22.50 μg、43.18 μg、91.09 μg、19.50 μg、39.55 μg的混合对照品溶液，备用。

取小儿消积通便颗粒约0.35 g，精密称定，置25 mL 带塞锥形瓶中，加入70% 甲醇10 mL，精密称定，超声30 min（功率280 W，频率53 kHz），冷却至室温，加70% 甲醇补足失重，摇匀，微孔滤膜滤过（0.45 μm），取续滤液，即得。

分别取缺胡黄连、焦山楂、姜厚朴、炒决明子、炒枳实、连翘的阴性制剂，制备方法同供试品溶液，分别制得各阴性供试品溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱：Hedera ODS-2 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.2%磷酸-水溶液（A）-乙腈（B），按表1 进行梯度洗脱；柱温：25 ℃；进样量：10 μL；流速：1.0 mL/min；检测波长：270 nm。

表1 梯度洗脱表/%

2.3 系统适用性试验

分别吸取对照品溶液、小儿消积通便颗粒供试品溶液及小儿消积通便颗粒阴性供试品溶液，按“2.2”项下的条件进行进样，得HPLC 色图谱，见图1。由图1A 可得，各有效成分保留时间分别为1 号峰：5-羟甲基糠醛（12.640 min），2号峰：连翘酯苷A（35.968 min），3 号峰：胡黄连苷Ⅱ（36.956 min），4 号峰：柚皮苷（43.290 min），5 号峰：橙皮苷（44.916 min），6 号峰：胡黄连苷Ⅰ（48.259 min），7号峰：连翘苷（60.807 min），8号峰：橙黄决明素（77.655 min），9 号峰：厚朴酚（86.683 min）。供试品与对照品在相同位置有吸收，阴性供试品无干扰。

图1 小儿消积通便颗粒混合对照品、供试品及各阴性样品色谱图：A 为混合对照品；B为供试品；C为缺胡黄连阴性样品；D为缺焦山楂阴性样品；E为缺姜厚朴阴性样品；F为缺炒决明子阴性样品；G为缺炒枳实阴性样品；H为缺连翘阴性样品

2.4 方法学考察

2.4.1

线性关系 精密吸取“2.1”项下的混合对照品溶液适量，分别加入甲醇稀释成2、4、10、20、40倍的混合对照品溶液，按“2.2”项下的条件进行含量测定。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得回归方程结果见表2。

表2 线性回归方程、线性范围及相关系数（r）

2.4.2

精密度试验 取稀释2倍的混合对照品溶液，重复进样6 次，测定，计算，5-羟甲基糠醛、连翘酯苷A、胡黄连苷Ⅱ、柚皮苷、橙皮苷、胡黄连苷Ⅰ、连翘苷、橙黄决明素、厚朴酚的峰面积相对标准偏差（RSD）为0.13%、0.38%、0.28%、0.44%、0.37%、0.61%、0.67%、0.45%、0.43%。结果表明，仪器精密度良好。

2.4.3

重复性试验 取190222 批小儿消积通便颗粒，分别精密称定约0.35g，共6份，依照“2.1”项下方法制备小儿消积通便颗粒供试品，按“2.2”项下的条件进行测定，计算。5-羟甲基糠醛、连翘酯苷A、胡黄连苷Ⅱ、柚皮苷、橙皮苷、胡黄连苷Ⅰ、连翘苷、橙黄决明素、厚朴酚的含量分别为158.15 μg/g、271.29 μg/g、43.18 μg/g、14.24 μg/g、171.56 μg/g、58.91 μg/g、25.47 μg/g、2.98 μg/g、9.21 μg/g；RSD分 别 为0.41%、0.32%、1.03%、2.34%、0.50%、0.54%、2.63%、2.60%、2.50%。结果表明，该方法重复性良好。

续图1 小儿消积通便颗粒混合对照品、供试品及各阴性样品色谱图：A为混合对照品；B为供试品；C为缺胡黄连阴性样品；D为缺焦山楂阴性样品；E为缺姜厚朴阴性样品；F为缺炒决明子阴性样品；G为缺炒枳实阴性样品；H为缺连翘阴性样品

2.4.4

稳定性试验 取同一供试品溶液，依法分别于0、2、4、8、12、24 h进样，计算。5-羟甲基糠醛、连翘酯苷A、胡黄连苷Ⅱ、柚皮苷、橙皮苷、胡黄连苷Ⅰ、连翘苷、橙黄决明素、厚朴酚的峰面积RSD 为0.18%、0.25%、1.09%、1.82%、0.95%、0.56%、1.99%、1.60%、2.71%。结果表明，该供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.4.5

加样回收率试验 称取已知含量的小儿消积通便颗粒（190222批）约0.175 g，共6份，分别精密加入等量对照品，依“2.1”项下的操作制备小儿消积通便颗粒供试品溶液，测定，计算。结果见表3。试验结果表明，该方法准确性良好。

表3 加样回收率试验表（n=6）

续表3 加样回收率试验表（n=6）

2.4.6

含量测定 分别称取小儿消积通便颗粒3批各0.35 g，精密称定，照“2.1”项下操作制备小儿消积通便颗粒供试品溶液，按“2.2”项下条件测定，计算。结果见表4。

表4 3批样品每袋的含量/（μg/g）

3 讨论

小儿消积通便颗粒由炒枳实、姜厚朴、炒白术、火麻仁、炒决明子、炒鸡内金、焦山楂、连翘和胡黄连组成。炒枳实为君药，其黄酮类成分柚皮苷和橙皮苷是理气、行滞、抗炎抗氧化的重要活性成分；姜厚朴为臣药，其特征性成分厚朴酚可剂量依赖性增加回肠纵行肌收缩频率和振幅，改善胃肠运动障碍和抗腹泻；胡黄连中胡黄连苷Ⅰ和胡黄连苷Ⅱ、连翘中的连翘酯苷A 和连翘苷、决明子中的橙黄决明素和焦山楂中的5-羟甲基糠醛具有抗菌消炎、抗氧化的作用；故将上述活性成分作为小儿消积通便颗粒的指标成分进行含量测定，可对其质量进行更全面的控制。

小儿消积通便颗粒含量测定方法研究过程中发现：柱温对胡黄连苷Ⅰ与胡黄连苷Ⅱ的分离度有一定影响，柱温在20～30 ℃内时对胡黄连苷Ⅰ与胡黄连苷Ⅱ变化较小，故择常规柱温25 ℃作为检测柱温。检测波长的选择上，连翘、胡黄连、枳实中的成分检测波长均在270 nm左右，故选择270 nm为检测波长。本实验还比较了不同流动相、不同分析时间等对色谱图的影响，发现以0.2% 磷酸水作为流动相，可改善连翘酯苷、胡黄连苷Ⅱ、橙皮苷等成分的峰形，故选择0.2% 的磷酸水溶液作为流动相。由于本研究涉及9 种成分的定量研究，分析时间对各峰的分离效果影响很大，前期实验尝试了多种梯度条件均未能在短时间内获得较好的分离效果，而最终确定的色谱条件则兼顾了分离效果与分析时间。

方法学考察表明，该方法重复性好、专属性强，可为小儿消积通便颗粒质量标准的建立提供参考，同时还可为其医疗机构制剂工艺过程研究与控制、稳定性研究等奠定基础。