血清微小RNA-181c、微小RNA-146a对急性脑梗死病人神经功能缺损及预后的影响

李汉颖，李汉宇，李增祥

急性脑梗死（acute cerebral infarction，ACI）是神经系统多发病与常见病，致残率、病死率较高，带来的社会及经济负担已成为全球性问题，因此加强其研究意义重大。微小RNA（microRNA，miR）是高度保守的短小RNA，能通过对靶miR 的降解、翻译、抑制介导转录后基因沉默，参与蛋白表达的调节，在神经系统疾病的发生、进展等过程中扮演重要角色。miR-181c、miR-146a 是miR 的两个亚型，与首发精神分裂症病人认知功能损伤、脑卒中后小胶质细胞/巨噬细胞极化密切相关。但对ACI 病人神经功能缺损及预后的影响尚不明确，本研究对此进行探讨，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取南阳市中医院2018年1月至2019年7月ACI 病人135 例作为研究对象。纳入标准：均符合ACI 诊断标准；首次发病；发病前无认知功能异常、精神障碍、肢体功能障碍。排除标准：合并恶性肿瘤者；老年痴呆者；感染类疾病者；血液系统疾病者；继发癫痫者；存在听力障碍者。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求，病人均对本研究知情，自愿签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1

神经功能评估 入院时采用美国国立卫生院神经功能缺损评分（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）评估病人神经功能，满分42分，分值越高，神经缺损越严重。

1.2.2

标本采集与检测 入院时、入院第3 天分别采集病人肘部静脉血5 mL，3500 r/min 离心15 min，取上清。加入细胞裂解液，总RNA 提取试剂盒（广州健仑生物科技有限公司）提取总RNA，紫外分光光度法检测提取总RNA 浓度与质量，采用逆转录试剂盒（南京亿迅生物科技有限公司）逆转录为互补DNA（cDNA），miR-181c 正向、反向引物分别为5’-AACAUUCAACCUGUCGGUGAGU-3’、5’-UCACCGACAGGUUGAAUGUUUU-3’，miR-146a 正向、反向引物分别为5’-GTTTACCTACTCGTCTCTGGTAC-3’、5’-CCTTATCCCAATACGTGTCGACATCAT-3’，反应体系包括引物、dNTP（百奥迈科生物技术有限公司）、Taq DNA 聚合酶（北京蓝博斯特生物技术有限公司）、靶序列DNA和PCR反应缓冲液（南京亿迅生物科技有限公司）共20 μL，PCR 反应条件为95 ℃5 min 预变性，95 ℃40 s 变性，60 ℃20 s 退火，72 ℃15 s延伸，以2表示目的基因表达量。

1.3 观察指标

（1）对比不同神经功能病人临床资料。（2）比较不同NIHSS 评分病人血清miR-181c、miR-146a 水平。（3）分析血清miR-181c、miR-146a 与NIHSS评分相关性。（4）比较不同预后病人血清miR-181c、miR-146a 水平。（5）分析血清miR-181c、miR-146a 与预后的相关性。（6）分析血清miR-181c、miR-146a 预测预后的截断值、灵敏度、特异度。（7）比较血清miR-181c、miR-146a高危、低危病人生存曲线。

2 结果

2.1 一般资料

两组年龄、发病至入院时间、体质量指数等一般资料均衡可比（

P

＞0.05），见表1。

表1 不同美国国立卫生院神经功能缺损评分（NIHSS）急性脑梗死病人临床资料对比

2.2 不同NIHSS 评分病人血清miR-181c、miR-146a水平

NIHSS评分≥16分病人血清miR-181c水平高于5～15分、＜5分病人，miR-146a 水平低于5～15分、＜5分病人（

P

＜0.05），见表2。

表2 不同美国国立卫生院神经功能缺损评分（NIHSS）急性脑梗死病人血清miR-181c、miR-146a水平比较/±s

2.3 血清miR-181c、miR-146a 与NIHSS 评分相关性

Pearson相关性分析，血清miR-181c与NIHSS评分呈正相关（

r

=0.704，

P

＜0.001），miR-146a 与NIHSS评分呈负相关（

r

=-0.695，

P

＜0.001）。

2.4 不同预后病人血清miR-181c、miR-146a 水平

根据30 d 预后分为生存者、死亡者。生存者入院时、入院第3 天血清miR-181c 水平低于死亡者，miR-146a水平高于死亡者（

P

＜0.05），见表3。

表3 不同预后急性脑梗死病人血清miR-181c、miR-146a水平比较/±s

2.5 血清miR-181c、miR-146a 与预后的关系

以ACI病人预后作为因变量（生存=0，死亡=1），采用向后剔除法筛选变量，

α

=0.10，血清miR-181c、miR-146a 作为自变量（以所有病人平均值为界：≤平均值=1，＞平均值=2；血清miR-181c 平均值为1.50，miR-146a 平均值为0.70），logistic 回归分析显示，血清miR-181c、miR-146a 与预后显著相关（

P

＜0.05），见表4。

表4 血清miR-181c、miR-146a与135例急性脑梗死预后的关系

2.6 血清miR-181c、miR-146a 对预后预测价值

ROC 曲线分析显示，入院时第3 天miR-146a 预测预后的AUC 最大，为0.803，当截断值≤0.69 时，灵敏度为91.67%，特异度为68.18%。见表5。

表5 血清miR-181c、miR-146a对135例急性脑梗死预后预测价值的ROC分析结果

2.7 生存分析

以入院第3 天ROC 曲线最佳截断值为分界，分为miR-181c 高危（＞1.42）与低危（≤1.42）、miR-146a 高危（≤0.69）与低危（＞0.69）。miR-181c高危与低危（

χ

=16.201）、miR-146a高危与低危（

χ

=12.823）生存曲线比较，差异有统计学意义（均

P

＜0.001）。

3 讨论

3.1 研究的意义

目前ACI 的治疗手段主要包括抗凝、溶栓、神经营养等，虽能在一定程度上改善预后，但仍存在较大比例病人发生明显的神经功能缺损，导致功能障碍，并影响病人预后，因此研究与神经功能缺损相关的分子机制至关重要。

3.2 血清miR-181c 对ACI 病人神经功能缺损及预后的影响

miR-181c 来源于核内基因组，可移位至线粒体，并影响其基因组编码蛋白质的合成。Ma等报道显示，卒中病人的血miR-181c 水平与健康个体相比，差异有统计学意义。Zhang 等采用小核仁RNA 宿主基因6 靶向miR-181c，发现神经元凋亡情况与空白对照呈现出显著差异，提示miR-181c可调控神经元的凋亡。本研究发现，NIHSS评分≥16分病人血清miR-181c 水平高于5～15分、＜5分病人，且死亡病人入院时、入院第3 天miR-181c 高于生存者，提示神经功能缺损严重病人和死亡病人，血清miR-181c 水平较高，并与NIHSS 评分呈正相关，与预后显著相关，表明miR-181c 可影响病人神经功能与预后，可能为评估ACI 后神经功能与预后提供了一个思路。王志等发现，预后不良脑梗死病人入院时血清miR-181c 水平高于预后良好者，与病人预后密切相关，本研究结论与之相似。miR-181c 可介导脑缺血后肿瘤坏死因子-α 等炎性因子的释放，直接损伤神经元，并能通过转移至线粒体，调节相关蛋白的表达，引起线粒体复合物Ⅳ的重构与线粒体功能紊乱，减弱线粒体呼吸作用，加重缺血损伤与神经功能缺损程度，故可影响病人预后。同时本研究还发现，miR-181c 高危与低危病人生存曲线存在显著差异，直接佐证了miR-181c 表达水平可影响病人预后。且入院第3 天miR-181c 预测预后的AUC大于入院时，为0.779，呈现出较高的价值，可为临床预测预后提供量化参考。

3.3 血清miR-146a 对ACI 病人神经功能缺损及预后的影响

miR-146a 与细胞侵袭、转移、免疫、炎症和细胞凋亡高度相关。Zhou 等研究表明，脑缺血再灌注损伤后，miR-146a 表达下调，而采用miR-146a 模拟物上调miR-146a 的表达，有效降低了Caspase7 水平，减少了神经细胞的凋亡，呈现出神经保护作用。本研究发现，NIHSS 评分≥16分病人血清miR-146a 水平，低于5～15分、＜5分病人，且死亡病人入院时、入院第3 天miR-146a 低于生存者，提示神经功能缺损严重病人和死亡病人，血清miR-146a水平较低，并与NIHSS 评分呈负相关，与预后显著相关，表明检测血清miR-146a 表达可评估病人神经功能与预后，上调miR-146a 表达可能为ACI 病人神经功能、预后的改善提供了一个潜在靶点。刘明等报道显示，脑梗死病人血清miR-146a 表达与脑梗死病人NIHSS 评分呈负相关，支持本研究结论。关于miR-146a 改善神经缺损与预后的机制可能有：（1）miR-146a 的上调，能通过负调节Janus 相关激酶2/转录激活因子3 信号通港路，抑制神经细胞凋亡，改善炎症反应，从而发挥抗缺血性损伤的神经保护作用；（2）miR-146a 能通过调控内皮细胞，抑制血管收缩，舒张血管，改善脑缺血状态；（3）miR-146a高表达可抑制中性粒细胞、内皮细胞、趋化因子等，改善血液黏稠性，抑制血栓形成，有利于ACI后缺血灶血流的恢复。同时本研究显示，以ROC分析最佳截断值为分界，miR-146a 高危与低危者生存曲线比较差异显著，再次证实miR-146a 对病人预后的影响。ROC分析显示，入院时第3 天miR-146a 预测预后的AUC 最大，为0.803，当截断值≤0.69 时，灵敏度为91.67%，特异度为68.18%，可为临床选取合适指标预测预后提供参考。本研究不足之处在于，病例数较少，仍需后续扩大样本量进行验证。

血清miR-181c、miR-146a 与ACI 病人神经功能缺损及预后显著相关，均具有较高的预后预测价值，可能为ACI病人神经功能、预后的改善提供了一个潜在靶点。