牛奶中抗生素残留检测试剂盒的优化

陈芊汝，朱昱兴，寇玲赟，李昀，陶文靖，王莹

(1. 青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛 266109；2.北京美正生物科技有限公司，北京102200)

牛奶是一种古老的天然饮料，营养全面易吸收，具有极高的营养价值。然而，由于奶农在奶牛饲养过程中滥用抗生素或将抗生素作为防腐剂直接添加到牛奶中，导致牛奶抗生素残留是目前世界奶业存在的一个普遍问题[1-3]。长期食用抗生素残留超标的牛奶会提高人体内细菌的耐药性，破坏人体肠道菌群稳态，引发相关疾病，同时降低抗生素药物的治疗效果，危害身体健康[4]。因此对牛奶中抗生素残留的快速检测是乳业监管过程中亟需解决的技术问题。

利用抗生素抑制芽孢杆菌萌发产酸，在试剂盒中通过指示剂颜色的变化判断牛奶中是否有抗生素残留，是目前快速检测中常用的方法。但该类试剂盒市场长期被国外垄断，价格昂贵，检测成本较高。研究团队前期从山东即墨温泉中筛选出一株嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)，本文将以其作为指示菌研制牛奶抗生素残留快速检测试剂盒，通过添加固体介质和表面活性剂优化其液体发酵方法，提高芽孢产率及产量，降低试剂盒生产成本[5-6]。通过向试剂盒培养基中分别添加不同种类的芽孢激活剂[7-8]，优化培养温度、加样量，进一步缩短试剂盒的响应时间，从而提高试剂盒的检测效率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

嗜热脂肪地芽孢杆菌(实验室前期从山东即墨温泉中筛选得到)，无抗奶(内蒙古伊利实业集团股份有限公司)，营养肉汤、营养琼脂(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)，牛肉膏(北京市奥博星生物技术有限责任公司)，MnCl2(天津市光复精细化工研究所)，溴甲酚紫、甲氧苄氨嘧啶、次黄嘌呤(上海源叶科技有限公司)，琼脂粉、Tris、溶菌酶(北京索莱宝科技有限公司)，甘氨酸(河北华阳生物科技有限公司)，胰蛋白胨(赛默飞世尔科技公司)，K2HPO4(天津市鼎盛新化工有限公司)，葡萄糖、阿莫西林、氨苄西林、青霉素G、头孢氨苄、头孢噻呋、四环素、金霉素、土霉素、强力霉素、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺噁唑、磺胺噻唑、链霉素、庆大霉素、新霉素、卡那霉素、红霉素、泰乐菌素(国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 仪器与设备

SHA-B水浴恒温振荡器(常州国华电器有限公司)， pH计(上海奥豪斯仪器有限公司)，电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)， TGL-16M高速台式冷冻离心机(上海跃进医疗器械厂)。

1.3 方法

1.3.1 培养基的配制

发酵培养基：营养肉汤18 g/L，MnCl20.125 g/L，牛肉膏1.8 g/L。检测培养基1：琼脂粉33 g/L，葡萄糖1 g/L，溴甲酚紫10 g/L，用1 mol/L Tris调pH至8.2。检测培养基2：甘氨酸与次黄嘌呤质量比为1∶2(总量为0.5 g/L)，甲氧苄氨嘧啶4 mg/mL，溶菌酶15 μg/mL，葡萄糖10 g/L，胰蛋白胨5 g/L，K2HPO41 g/L，琼脂粉10 g/L，溴甲酚紫10 g/L，用1 mol/L Tris调pH至8.2。

1.3.2 基础发酵方法

取一环活化后的菌种接入发酵培养基，置于55 ℃，120 r/min水浴摇床培养12 h，进行种子液活化。按照10%的接种量，将种子液接入发酵培养基中，置于55 ℃，120 r/min水浴摇床培养8 h。

1.3.3 芽孢产率及产量的计算

将一滴菌悬液用酒精灯固定于载玻片中央，70 ℃条件下滴加质量体积分数为7.6%的孔雀石绿，染色10 min后用清水缓慢洗净。待其干燥后用沙黄复染5 min，用清水洗净、烘干，置于100倍镜下观察。

取发酵完毕后的液体发酵液离心(5 000 r/min，4 ℃，10 min)，弃去上清液。用蒸馏水复溶，再次离心(5 000 r/min，4 ℃，10 min)。重复3次后，所得沉淀的质量，即为液体发酵的芽孢产量。

1.3.4 芽孢的制备

将活化后菌种转接至营养琼脂培养基，嗜热脂肪地芽孢杆菌置于65 ℃培养24 h，用无菌生理盐水将平板上的菌苔洗下，离心(5 000 r/min，10 min)，弃上清液，按菌体质量的5倍复溶，置于100 ℃保温30 min，制成芽孢悬液。

1.3.5 试剂盒的制作与检测

灭菌后的检测培养基与40 μL/mL芽孢悬液(2.0 × 103CFU/mL)混匀，分装于300 μL的微孔板中(110 μL/孔)，用膜封板封口，常温放置20 min，待其凝固后试剂盒制作完成。检测时取100 μL的奶样加入上述微孔板中，置于65 ℃下培养。试剂盒本来是紫色的，若样品中没有抗生素，在合适温度下培养芽孢就会萌发，产酸变成黄色，若检测样品中含有抗生素，则芽孢萌发被抑制，试剂盒颜色不发生变化，如图1所示。

图1 试剂盒培养基的颜色变化Fig. 1 The color change of the detecting culture medium

1.3.6 固体介质和表面活性剂对芽孢产率及产量的影响

选择新鲜干净的玉米芯，洗净烘干后，打成碎屑备用；无菌纱布剪成1 cm×1 cm的小块备用；无菌脱脂棉撕碎备用；琼脂粉末，备用。在1.3.2基础发酵方法的基础上，一组向发酵培养基中分别添加2 g/L的上述固体介质，另一组分别添加7.5 g/L下述表面活性剂：聚乙二醇(Polyethylene glycol-6000，PEG-6000)、吐温-80、十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate，SDS)、十六烷基三乙基溴化铵(Hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)，每组设置3个重复，以研究不同固体介质和表面活性剂的添加对液体发酵芽孢产率及产量的影响。

1.3.7 芽孢激活剂和激活条件对响应时间的影响

向检测培养基中分别添加不同种类的糖类、氨基酸类、核苷类芽孢激活剂，每种激活剂添加量为1 g/L。参照1.3.5的方法，进行最适芽孢激活剂的选择。随后在上述试验的基础上进行最适检测条件的探索，分别向试剂盒中添加40～120 μL无抗奶样，置于55～75 ℃下观察试剂盒响应时间的变化。每组进行3次平行试验，研究不同芽孢激活剂和激活条件对试剂盒响应时间的影响。

1.3.8 国内外试剂盒效果对比

选择本试剂盒、国产试剂盒(北京美正生物科技SC007试剂盒)、进口试剂盒(荷兰DSM公司Delvotest®BR试剂盒、西班牙ZEU-INMUNOTEC公司Eclipse 50试剂盒)分别在其规定培养条件下进行不同抗生素药物检测限和检测时间的比较。本试剂盒的培养温度选择65 ℃，加样量为100 μL。每种检测试剂盒设置3组平行和1个阴性对照，以阴性对照变黄作为检测结束指标。

1.3.9 统计分析

试验数据以平均值±标准差(M ± SD)表示，采用GraphPad Prism 9.0.0软件进行统计学分析。分析方法为单因素方差分析和邓肯多重比较，显著性水平选择0.05。

2 结果与分析

2.1 不同表面活性剂对液体发酵芽孢产率及产量的影响

由图2可知，不同表面活性剂对液体发酵芽孢产率具有不同影响，对芽孢产量无影响。其中添加PEG-6000时，对芽孢的生成具有促进作用，芽孢产率最高(60%)，与空白相比芽孢产率提高了一倍(P<0.05)。而当添加吐温-80、SDS和CTAB时，所用试剂浓度偏高，可能会造成菌体的部分死亡，从而导致芽孢生成量降低，进而体现为对芽孢的生成具有抑制作用[9]。

图2 不同表面活性剂对芽孢产率及产量的影响Fig. 2 Effect of different surfactants on spore yield rate and spore output

2.2 不同固体介质对液体发酵芽孢产率及产量的影响

由图3可知，不同固体介质添加对液体发酵芽孢产率及产量具有不同影响。与空白相比，四种固体介质均具有提高芽孢产率的作用(P<0.05)。其中添加脱脂棉组的芽孢产率和产量为四种介质中最高，分别为69.67%和2.03 g/L。添加琼脂的芽孢产率与脱脂棉介质无显著性差异(P>0.05)，但芽孢产量显著低于添加脱脂棉(P<0.05)。添加玉米芯与纱布介质与空白组的芽孢产量无显著性差异(P>0.05)。综上所述，当固体介质为脱脂棉时，芽孢产率和产量都处于较高水平。

图3 不同固体介质对芽孢产率及产量的影响Fig. 3 Effect of different solid media on spore yield rate and spore output

2.3 不同糖类激活剂对试剂盒响应时间的影响

由图4可知，不同糖类激活剂对试剂盒响应时间具有显著性影响。与空白组相比，葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖均可缩短试剂盒的响应时间(P<0.05)。其中添加葡萄糖激活剂试剂盒响应时间最短，为200 min。添加果糖和乳糖试剂盒响应时间无显著性差异(P>0.05)，分别为208 min和213 min。空白组和蔗糖组的响应时间最长且二者无显著性差异(P>0.05)。综上所述，葡萄糖为最适糖类激活剂。

图4 不同糖类激活剂对试剂盒响应时间的影响Fig. 4 Effect of different carbohydrate activator on the response time of the kit

2.4 不同氨基酸激活剂对响应时间的影响

由图5可知，不同氨基酸类激活剂对试剂盒响应时间具有显著性影响。与空白组相比，甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的添加均可缩短试剂盒的响应时间(P<0.05)。其中添加甘氨酸激活剂试剂盒响应时间最短，为181 min。添加丙氨酸和天冬氨酸试剂盒响应时间无显著性差异(P>0.05)，分别为208 min和213 min。添加谷氨酸的试剂盒响应时间最长，为221 min。综上所述，添加甘氨酸试剂盒的响应时间最短，因此甘氨酸为最适氨基酸类激活剂。

图5 不同氨基酸激活剂对试剂盒响应时间的影响Fig. 5 Effect of different amino acid activator on the response time of the kit

2.5 不同核苷类激活剂对响应时间的影响

由图6可知，不同核苷类激活剂对试剂盒响应时间具有显著性影响。与空白相比，次黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶的添加均可缩短试剂盒的响应时间(P<0.05)。其中添加次黄嘌呤激活剂试剂盒响应时间最短，为178 min。添加胞嘧啶的试剂盒响应时间为190 min。添加鸟嘌呤和胸腺嘧啶试剂盒响应时间无显著性差异(P>0.05)，分别为196 min和193 min。添加腺嘌呤的试剂盒响应时间最长为200 min。综上所述，添加次黄嘌呤试剂盒的响应时间最短，因此次黄嘌呤为最适核苷类激活剂。

图6 不同核苷类激活剂对试剂盒响应时间的影响Fig. 6 Effect of different nucleoside activator on the response time of the kit

2.6 甘氨酸与次黄嘌呤结合对响应时间的影响

由上述试验可得，添加最适糖类激活剂葡萄糖的响应时间为200 min，最适氨基酸激活剂甘氨酸响应时间为181 min，最适核苷类激活剂次黄嘌呤响应时间为178 min。研究表明，多种营养素结合可能会产生协同作用[10]。由于三类激活剂中，氨基酸和核苷类激活剂效果相对明显，因此选择将甘氨酸与次黄嘌呤搭配使用，研究添加不同比例甘氨酸和次黄嘌呤对试剂盒响应时间的影响。由图7可知，当甘氨酸与次黄嘌呤的添加比例为1∶2时，试剂盒响应时间可缩短至155 min，低于二者单独使用。因此甘氨酸与次黄嘌呤结合使用具有协同作用，可缩短芽孢萌发时间，提高试剂盒响应速度。

图7 不同甘氨酸与次黄嘌呤添加比例对试剂盒响应时间的影响Fig. 7 Effect of different glycine to hypoxanthine weight ratio on the response time of the kit

2.7 不同检测温度对试剂盒响应时间的影响

由图8可知，不同的检测温度下试剂盒对无抗奶的响应时间不同。当检测温度在65 ℃时，响应时间最短，为155 min。当检测温度低于65 ℃时，响应时间随着检测温度的升高而缩短。当检测温度高于65 ℃时，响应时间上升。70 ℃与75 ℃温度下，响应时间无显著性差异(P>0.05)。检测温度过高或过低，达不到芽孢最适萌发温度，都会阻碍芽孢的萌发。

图8 不同检测温度对试剂盒响应时间的影响Fig. 8 Effect of different test temperature on the response time of the kit

2.8 不同加样量对试剂盒响应时间的影响

由图9可知，随着加样量的增加，响应时间减少。当加样量为40 μL时，试剂盒的响应时间最长，可能是由于牛奶中包含一定芽孢萌发所需要的营养，牛奶过少，芽孢所摄取的营养过少，导致响应时间延迟。当加样量为80 μL时，响应时间为150 min。当加样量大于80 μL时，响应时间并未继续缩短，甚至产生渗奶现象。因此最适加样量为80 μL。

图9 不同加样量对试剂盒响应时间的影响Fig. 9 Effect of different loading volume on the response time of the kit

2.9 与市售国内外试剂盒效果对比

如表1和图10所示，三种市售牛奶抗生素残留检测试剂盒的响应时间均在165 min左右，而本研究优化的试剂盒检测时间可以缩短到150 min。国产检测试剂盒对磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、林可霉素、替米考星、螺旋霉素5种抗生素药物无敏感性；对阿莫西林、链霉素、卡那霉素、红霉素的检测限过高，超过我国国家标准。荷兰Delvotest®BR试剂盒对磺胺噁唑、磺胺间甲氧嘧啶无敏感性；对青霉素，四环素、金霉素、土霉素、强力霉素、磺胺二甲嘧啶、链霉素、卡那霉素、螺旋霉素检测限过高，不符合我国国家标准。西班牙Eclipse 50试剂盒对金霉素、强力霉素、磺胺间甲氧嘧啶、新霉素、替米考星无敏感性；对磺胺二甲嘧啶、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、红霉素、螺旋霉素检测限过高，不符合我国国家标准。而本试剂盒除了对磺胺二甲嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶没有敏感性，对其余21种国标要求的抗生素均具有敏感性，且检测限均符合我国国家标准。后续仍需要对磺胺类抗生素敏感性的问题进行进一步研究。

图10 与国内外市售牛奶抗生素检测试剂盒检测时间对比Fig. 10 Comparison of the response time withdomestic and foreign commercial milk antibiotic test kits注：不同字母表示不同组间具有显著性差异(P<0.05)。

表1 与国内外市售牛奶抗生素检测试剂盒的抗生素检测限对比Table 1 Comparison of the detection limit of domestic and foreign commercial milk antibiotic test kits

3 讨论

本研究通过添加表面活性剂、固体介质提高液体发酵制备芽孢的产率和产量，结果表明，PEG-6000和脱脂棉可提高芽孢产率及产量。PEG-6000可增加嗜热脂肪地芽孢杆菌液体芽孢产率，可能是由于PEG可促芽孢杆菌生物膜的形成[5]。生物膜的形成可能会导致发酵液中细胞密度过高，细菌代谢产物高度积累，引起细胞渗透压过高，使细菌处于不利环境中，可能因此诱发了芽孢的产生[11]。添加脱脂棉等固体介质可增加液体发酵芽孢产量，这与王天云等[4]的研究结果相似。经试验验证，当接菌量为10%、添加7.5 g/L PEG-6000、3 g/L脱脂棉、pH为8、培养温度为55 ℃的培养条件下，发酵8 h，芽孢产率可达79%，芽孢产量达2.5 g/L。该方法可大幅降低商业化生产牛奶抗生素残留检测试剂盒的生产成本。

通过对比不同糖类、氨基酸类、核苷类芽孢激活剂对试剂盒响应时间的影响，发现最适糖类芽孢激活剂为葡萄糖，最适氨基酸芽孢激活剂为甘氨酸，最适核苷类芽孢激活剂为次黄嘌呤，将甘氨酸与次黄嘌呤协同使用，效果更佳。陈国华等[12]研究表明，诱导苏云金杆菌萌发的必需氨基酸为缬氨酸与丙氨酸。李素等[13]研究发现，仅有葡萄糖可诱导凝结芽孢杆菌的萌发。可见不同菌种所需诱导剂不同，这可能与位于芽孢内膜上的营养素受体有关，不同菌种芽孢内膜上的营养素受体和敏感度不同，所能够结合的营养素也不同。

另外，试验确定了牛奶抗生素残留检测试剂盒的最佳检测温度为65 ℃，最适样品加样量为80 μL。在与市售国内外牛奶抗生素残留检测试剂盒对比后发现，本检测试剂盒具有灵敏度高、检测时间短的优势，且制造成本低，具有良好的市场前景和商业价值。