血小板体外对中性粒细胞抗真菌作用的影响

司 玮，张芬芬，王春梅，刘素素，岳 娟，简守珺，张红敏

1)郑州大学人民医院眼科；河南省立眼科医院；河南省眼科学与视觉科学重点实验室 郑州 450003 2)德州市人民医院眼科 山东 德州 253003

真菌性角膜炎是一种临床上常见的致盲性、真菌感染性眼病，是我国角膜移植的主要原因[1-3]。真菌性角膜炎免疫反应过程中，中性粒细胞发挥着关键的抗真菌作用[4-6]。我们前期的研究显示，血小板围绕真菌性角膜炎小鼠模型真菌感染病灶形成血小板浸润带；腹腔注射血小板中和抗体去除血小板后，真菌性角膜炎感染严重，菌丝量大，角膜临床症状加重；提示血小板参与了角膜的抗真菌感染过程(未发表资料)。近来许多研究[7-10]表明，血小板除了在血栓形成和止血中发挥调节功能外，在免疫防御方面也发挥着重要作用。我们采用中性粒细胞、血小板和真菌体外共培养的方法，观察血小板的体外抗真菌作用，为真菌性角膜炎的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

1.1.1实验试剂 RPMI 1640培养液、红细胞裂解液(北京索莱宝科技有限公司)；马铃薯葡萄糖琼脂培养基(青岛海博生物技术有限公司)；EDTA-K2抗凝管(湖南三力医用科技发展有限公司)；Percoll分离液(美国GE Healthcare公司)；瑞姬氏染液(南京建成科技有限公司)；钙荧光白(美国Fluka公司)；抗人CD41a-PE、抗人CD15-FITC、FITC-Annexin V/PI凋亡检测试剂盒(美国BD公司)。

1.1.2实验仪器 细胞培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)、真菌生化培养箱(中国广东省医疗器械厂)、离心机(美国Beckman Coulter公司)、微量移液器(法国Gilson公司)、转盘共聚焦显微镜(英国Andor公司)。

1.2 真菌菌株来源及真菌孢子的提取腐皮镰胞菌标准株，编号3.5840，购自中国科学院微生物研究所，用马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养于28 ℃霉菌培养箱内。参考文献[11]方法，选取培养4～7 d、状态良好的菌株用于实验。于培养真菌菌株的玻璃试管中，加入2～3 mL无菌RPMI 1640培养液，用无菌吸管轻轻从琼脂斜面刮取真菌菌落，吹打混匀，使真菌菌丝和孢子悬浮，用对折两次的无菌纱布将真菌混悬液过滤，滤除菌丝，将包含孢子的滤液收集至无菌离心管中并300×g离心5 min，收集孢子，用血细胞计数板显微镜下计数孢子数目，置于冰盒中备用。

1.3 人外周血血小板和中性粒细胞的分离

1.3.1人外周血来源 健康志愿者入选标准：年龄18～35岁；15 d内无感染性疾病发生，3个月内未应用抗生素；无全身性疾病；6个月内无献血史。排除妊娠和生理期女性。本研究通过河南省立眼科医院医学伦理委员会的审批，批准号：HNEECKY-2018(1)。单次采集健康志愿者外周静脉全血15 mL至EDTA-K2抗凝管中，颠倒混匀后300×g离心10 min。上层为富血小板血浆层，下层为细胞层。

1.3.2血小板的分离 参考文献[11]方法，全血离心后，吸取上层富血小板血浆于新离心管中600×g离心10 min，白色沉淀即为血小板。取2 μL血小板沉淀均匀涂布于载玻片上，用瑞姬氏染液染色后在光学显微镜下进行纯度计数，选取纯度大于95%的血小板进行实验。取血小板,加入1 mL培养基轻轻重悬，制成均匀的血小板悬液，用血细胞计数板在显微镜下计数，置于常温备用。

1.3.3中性粒细胞的分离 全血离心后，收集下层细胞层至离心管内，加入细胞层3倍体积的红细胞裂解液，混匀，冰盒中避光裂解10～12 min，300×g离心5 min，白色沉淀即为白细胞层。使用Percoll梯度离心法600×g离心20 min得到中性粒细胞[12]。经纯度鉴定后制备细胞悬液并计数，方法同1.3.2，置于常温备用。

1.4 中性粒细胞吞噬率测定实验分为孢子(S)+中性粒细胞(N)组和S+N+血小板(PL)组。预先分别用体积分数0.2%钙荧光白(蓝色)、抗人CD15-FITC(绿色)和抗人CD41a-PE(红色)标记孢子、中性粒细胞和血小板。将中性粒细胞均匀接种于12孔板中，每孔5×105个，每组接种2孔。S+N组按照孢子∶中性粒细胞个数1∶1的比例加入孢子；S+N+PL组按照孢子∶中性粒细胞∶血小板个数1∶1∶20的比例加入孢子和血小板；用RPMI 1640培养液将每孔定容至1.5 mL并将孔板放入转盘共聚焦显微镜活细胞孵育培养系统(37 ℃、体积分数5%CO2、95%湿度)内进行培养，分别于培养1、2、4 h后每组选取20倍物镜下5个视野拍照。将各通道荧光图片与光学图片融合后，计数5个视野中的中性粒细胞总数、吞噬孢子的中性粒细胞数。中性粒细胞吞噬率=吞噬孢子的中性粒细胞数/中性粒细胞总数×100%。实验重复8次。

1.5 孢子出芽率和菌丝伸长度测定实验分为S组、S+N组、S+N+PL组，S∶N∶PL个数比例为1∶5∶100。将中性粒细胞均匀接种于12孔板中，每孔5×105个，每组接种2孔，余铺板、染色及计数方法同1.4。①分别于培养1、2、4 h后每组选取20倍物镜下5个视野拍照。将各通道荧光图片与光学图片融合后，计数5个视野中出芽孢子个数及孢子总数。孢子出芽率=出芽孢子个数/孢子总数×100%。实验重复7次。②分别于培养4、6、8 h后，每组选取20倍物镜下5个视野拍照，用Imaris 7.2测量视野内所有完整真菌菌丝长度。实验重复7次。

1.6 中性粒细胞凋亡率测定实验分为N组、S+N组、S+N+PL组，S∶N∶PL个数比例为1∶5∶100。将中性粒细胞均匀接种于12孔板中，每孔5×105个，每组接种2孔，培养条件同1.4。分别于培养6、10、14、18 h后，按照凋亡检测试剂盒说明书操作检测凋亡的中性粒细胞。在相应孔内加入Annexin V和PI试剂，避光孵育15 min后放置于转盘共聚焦显微镜的活细胞孵育培养系统中，每组在20倍物镜下选取5个视野拍照。仅Annexin V着染的为早期凋亡细胞，Annexin V与PI双染的为晚期凋亡细胞。计数5个视野中荧光着染的中性粒细胞数及中性粒细胞总数。中性粒细胞凋亡率=荧光着染的中性粒细胞数/中性粒细胞总数×100%。实验重复6次。

1.7 统计学处理采用SPSS 21.0进行统计分析。各组间中性粒细胞吞噬率及凋亡率、孢子出芽率的比较采用单因素方差分析(两两比较采用LSD-t检验)或两独立样本的t检验；菌丝伸长度为非正态分布，同一时间点组间比较均采用Kruskal-WallisH检验；检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 S+N组和S+N+PL组中性粒细胞吞噬率的比较见图1、表1。S+N+PL组中性粒细胞吞噬率大于S+N组。

蓝色：孢子；绿色：中性粒细胞；红色：血小板；白色箭头示中性粒细胞吞噬真菌孢子图1 两组中性粒细胞吞噬真菌孢子的表现

表1 S+N组和S+N+PL组中性粒细胞吞噬率的比较 %

2.2 3组孢子出芽率和菌丝伸长度的比较见图2、3和表2。S+N+PL组孢子出芽率和菌丝伸长度小于S+N组和S组；S+N组孢子出芽率小于S组，6 h时的菌丝伸长度小于S组。

表2 3组孢子出芽率和菌丝伸长度比较

2.3 3组中性粒细胞凋亡率的比较见图4、表3。S+N+L组中性粒细胞凋亡率小于S+N组和N组。

蓝色：孢子；绿色：中性粒细胞；红色：血小板；白色箭头示孢子出芽图2 3组孢子出芽的表现

蓝色：孢子；绿色：中性粒细胞；红色：血小板；白色箭头示真菌菌丝；黑色箭头示为被中性粒细胞包裹的菌丝图3 3组菌丝的表现

蓝色：真菌；绿色：Annexin V染色；红色：PI染色；白色箭头示早期凋亡细胞；黑色箭头示晚期凋亡细胞图4 3组中性粒细胞凋亡现象

表3 3组中性粒细胞凋亡率比较 %

3 讨论

大量文献[9-11]显示，天然免疫的早期应答对真菌感染的转归起着决定性作用。天然免疫细胞包括中性粒细胞、巨噬细胞等，它们不但可直接吞噬真菌孢子或胞外捕获真菌菌丝，分泌抗真菌成分，产生的化学因子和细胞因子还可启动获得性免疫，其中中性粒细胞起着尤为重要的作用[4-6,13]。中性粒细胞减少者易患黏膜真菌病，且真菌很容易播散[14]。真菌感染的角膜各层中均有大量多形核中性粒细胞浸润，细胞的分布和浸润程度与菌丝的分布和密度呈负相关。

血小板是骨髓巨核细胞脱落下来的胞质小块，在外周血中的寿命为8～10 d。血小板是除红细胞外，数量最多的血液有形成分，以往认为其主要参与止血、血栓形成和伤口愈合等病理生理过程，近年来人们发现血小板具有重要的免疫功能，在天然免疫和获得性免疫以及炎症等方面发挥重要作用[10-11，14-15]。Chatterjee等[16]报道，抗体依赖的血小板去除鼠角膜上皮被刮除后，角膜创伤部位中性粒细胞明显减少，创伤愈合明显延迟[16]。最近的研究[17]表明：中性粒细胞的杀菌作用依赖于血小板的参与，如中性粒细胞杀灭疟原虫的作用依赖于血小板的活化和聚集，革兰阴性菌感染的牙周组织中白细胞的吞噬功能依赖于血小板、血浆因子和TLR2。

已有研究[18]在分析白色念珠菌引起的全身性念珠菌病与全血的关系时，认为以小鼠中性粒细胞、白色念珠菌与血小板个数按1∶10∶100的比例用于实验较为合适。本研究以该浓度为基准进行预实验，最终以血小板与孢子个数按20∶1的比例进行实验。结果显示，加入血小板后中性粒细胞对真菌的吞噬作用增强，且真菌孢子的出芽率和菌丝伸长度下降，中性粒细胞凋亡率降低，表明血小板可增强中性粒细胞对真菌的吞噬，且对菌丝生长有抑制作用。

Haselmayer等[19]的研究结果表明血小板可促进中性粒细胞的活化，激活中性粒细胞呼吸爆发，释放IL-8和髓过氧化物酶等多种物质。Chatterjee等[16]的研究结果显示血小板衍生的CXCL12可通过CXCR7促进单核细胞的存活，从而显著抑制单核细胞凋亡。Au等[20]的研究结果表明活化的血小板可释放一种非典型的表皮生长因子受体激动剂，该激动剂通过旁分泌信号，维持依赖于DNA依赖蛋白激酶的DNA修复，从而有效抑制神经细胞凋亡。我们推测血小板增强中性粒细胞的抗真菌作用可能是通过促进中性粒细胞活化，激活中性粒细胞呼吸爆发，释放髓过氧化物酶等多种杀真菌效应物质来实现的，但是具体的作用机制尚待进一步研究。

本研究应用血小板、中性粒细胞和腐皮镰孢菌共培养体系，采用免疫荧光和转盘共聚焦技术，证实了血小板体外可增强中性粒细胞对真菌的吞噬，抑制真菌的出芽和菌丝的生长，同时降低中性粒细胞的凋亡，提示血小板在抗真菌感染中发挥了重要作用，这为真菌性角膜炎的治疗提供了新思路。