番茄响应非生物胁迫相关miRNA研究进展

裴玲玲 刘欣

（沈阳农业大学园艺学院，设施园艺省部共建教育部重点实验室，辽宁省设施园艺重点实验室，辽宁沈阳 110161）

MicroRNA（miRNA）是真核生物中长19～25 nt 的内源性非编码单链小RNA 分子（Yin et al.，2008），与靶mRNA 不完全互补配对。植物中，miRNA 根据与靶mRNA 的互补程度来选择切割靶mRNA 或抑制靶mRNA 的翻译，经转录后调控基因表达（Hammond et al.，2000；Voinnet，2009）。研究表明，miRNA 参与植物体内多种生物学过程，其表达量在植物生长发育的各阶段和不同环境条件下均发生变化，对植物生长发育起重要调节作用（韩璐和栾雨时，2014）。

第一个植物miRNA 于2002 年在拟南芥中被发现（Reinhart et al.，2002）。多年来，科学家们已经在植物中发现了数以万计的miRNA，这些miRNA大多存在于已经进行基因组测序的植物中。拟南芥中发现了428 个成熟miRNA，基因组分析计算烟草中有259 个潜在保守的miRNA（Griffiths-Jones et al.，2008；Frazier et al.，2010）。miRNA 在水稻、烟草等模式植物抗逆机制中的作用已有相关报道，如响应水稻冷害胁迫的miRNA 约有24 种，其中miR1425在水稻面临冷胁迫时会下调表达来提高耐冷性，而miR393的表达量持续上升以应对低温胁迫（Jain et al.，2007；Sunkar et al.，2007；高鹏，2008；Jeong &Green，2012；朱子亮，2017）。烟草中的miR398在干旱胁迫时表达量显著下调，提高了烟草体内活性氧清除系统的活性，增强烟草抗旱性（Chen et al.，2017；朱智威 等，2019）。

番茄是世界范围内广泛种植的果菜类蔬菜，有很高的营养价值和经济价值。因其基因组小，遗传背景清楚，具有完整的果实发育和成熟过程等特点，成为基础生物学研究中的重要模式植物（刘丽红，2015）。番茄在设施栽培条件下广泛种植，但设施生产中存在的化肥施用不当及作物对肥料的选择性吸收等现象会导致土壤养分失衡，矿质元素平衡被打破，各营养元素之间的拮抗、竞争、固定等作用极大限制了植物的正常生长发育（雷平，2010；朱潇婷，2021）。温度、光照、水分、氧气、矿质营养等是植物正常生长发育必需的环境条件，而番茄生产中经常面临低温、干旱、营养缺乏等问题，限制了植株正常生长发育，影响了果实品质和产量，显著降低了收获指数，甚至无法完成生命周期（Sunkar，2010）。

研究发现，miRNA 可以参与番茄新陈代谢、生长发育、逆境调控等过程。miRBase Release 20中收录了95 条成熟番茄miRNA 序列，并且不断有新的番茄miRNA 被分离鉴定，它们不仅参与根、茎、叶及果实的发育调控，还参与新陈代谢、激素调节、生物和非生物胁迫响应等过程（Zhao et al.，2017a）。近年来，越来越多的研究集中于番茄非生物胁迫相关的miRNA，如miR169s参与多种非生物胁迫响应过程；miR167在低温胁迫下表达量升高，且表达量越高番茄抗冷性越强；miR156a在干旱胁迫下表达量明显上调，其相应的SPL 靶基因应激后下调，番茄表现出更强的干旱耐受性（郭鹏 等，2014；Cui et al.，2014；Liu et al.，2017 a；Rao et al.，2020）。在番茄中过表达miR397a并进行盐胁迫处理，发现其体内活性氧清除系统活性降低，且种子发芽力减弱，说明miR397a在番茄响应盐胁迫机制中起负调控作用（庞明利，2008）。此外，miRNA 及其靶基因的表达模式在响应不同的番茄非生物胁迫过程中均有所不同，深入研究miRNA的分子调控机制将为番茄抗逆性的提高提供思路，本文综述了非生物胁迫下miRNA 在番茄中发挥的功能，为进一步分析miRNA 在番茄中的调控网络提供参考。

1 miRNA 简介

1.1 植物miRNA 的来源

miRNA 最初是1993 年Lee 等对秀丽隐杆线虫的早期发育进行遗传筛选时发现的，后来进一步研究发现它们广泛存在于真核生物及各种病毒中（Carrington &Ambros，2003；He et al.，2008；李瑞雪 等，2020）。

植物中的miRNA 主要来源于独立的转录单位，编码miRNA 的基因被RNA 聚合酶Ⅱ转录为长的初级转录本（pri-miRNA）；随后primiRNA 被切割成带有发夹结构的miRNA 前体（pre-miRNA），发夹的环结构区域被RNase Ⅲ家族Dicer 酶切除，其余部分构成miRNA/miRNA*双链复合体并转移到细胞质中，其中成熟miRNA并入AGO1 蛋白中形成活性RNA 诱导沉默复合物（RISC）；最终，RISC 被引导结合到相应的互补靶mRNA 位点进行切割或抑制翻译行使功能，另一条miRNA*逐渐降解（Kurihara &Watanabe，2004；Chen，2005；Lin et al.，2005；Yin et al.，2008；Axtell et al.，2011；Rogers &Chen，2013；Yu et al.，2017）。

1.2 miRNA 在植物中的功能

由于miRNA 的靶向mRNA 多数都是转录因子，这些转录因子几乎可以参与从种子发芽到成熟的全过程，所以认为miRNA 在植物生长发育中起重要的调节作用（Jones-Rhoades et al.，2006；Sunkar et al.，2012）。如在拟南芥中，miR160通过负调控生长素响应因子ARF10 和ARF16 的表达来控制根冠细胞的形成（邹臣华，2007）；在水稻中，miR159的沉默可使株高降低和茎粗减小（Zhao et al.，2017b）；miR319通过靶向转录因子TCP 来调控植物叶片形态建成，在拟南芥中过表达miR319叶片出现凸起褶皱（Palatnik et al.，2003）；CO 转录因子在植物开花光周期途径中发挥重要作用，过表达miR319植株中CO 转录因子表达量下调，可导致拟南芥开花提前（Liu et al.，2017a）；在拟南芥中过表达大豆miR172a也表现出植株开花提前（Wang et al.，2016）；桃果实中miR167a通过介导靶基因PpARF8的裂解影响生长素信号途径进而调控果实发育（张彦苹 等，2021）；在拟南芥DCL1突变体中抑制miR156的表达，其相应靶基因SPL10和SPL11表达提前，进而导致在种子发育后期表达的基因提前作用（Nodine &Bartel，2010）。研究表明，有些miRNA 与植物体内激素有关，如ARF 是生长素信号通路中的核心调控因子，拟南芥中约有1/3 的ARF 受miRNA 调控（张彦苹 等，2019）；乙烯在苜蓿根中可以抑制miR159的表达，miR159靶向脱落酸响应因子MYB，参与调控植物激素信号传导（Lei et al.，2012）；喷施外源ABA后，番茄中miR160、miR162、miR166、miR397、miR1919等均显著上调，通过分析miR160的靶基因启动子元件，发现其上含有脱落酸顺式作用元件，说明miR160通过靶基因响应ABA 信号途径（王孝 等，2016）。

1.3 miRNA 参与植物非生物胁迫响应

植物生长发育过程中不可避免会受到诸多环境因子的影响，一旦环境条件的变化幅度超过植物能承受的限值，其生长发育就会受到影响。miRNA在植物逆境响应机制中发挥正向或负向调控的作用。高温胁迫下，miR160在水稻和拟南芥中上调表达，相反在小麦和毛白杨中表达量下降（Li et al.，2015；Zhao et al.，2016；Lin et al.，2018；Rohit et al.，2021）。miR1425在水稻面临低温胁迫时会下调表达来提高耐冷性，相反，miR393的表达量持续上升以应对低温胁迫（Jain et al.，2007；Sunkar et al.，2007；高鹏，2008；Jeong &Green，2012；朱子亮，2017）。烟草中的miR398在面临干旱胁迫时表达量显著下调，提高体内活性氧清除系统的活性，增强烟草抗旱性（Chen et al.，2017；朱智威 等，2019）。低氮胁迫下，与野生型植株相比，拟南芥miR169a过表达株系的氮积累能力下降且对低氮更敏感，推测miR169a会削弱植物氮吸收系统的功能，起负调控作用（Zhao，2011）。拟南芥miR399过表达植株中磷的吸收和转运能力提高，但再循环利用被抑制，证明miR399在植物中起部分正调控作用（Aung et al.，2006）。缺氧胁迫下，杨树中miR472b和miR530的表达量随处理时间的延长而上升，发挥正向调控作用（Ren et al.，2012）。

2 番茄中参与非生物胁迫的相关miRNA

番茄在生长过程中会经受多种非生物胁迫，如温度胁迫、水分胁迫、矿质营养胁迫等。随着测序技术、靶基因预测技术、生物信息学分析技术和分子生物学实验技术的发展，越来越多与番茄响应非生物胁迫有关的miRNA 被发现。

2.1 温度胁迫

2.1.1 低温胁迫 番茄是喜温性作物，生长最适温度20～25 ℃，对低温敏感，轻中度低温会抑制植株生长，进而导致根系生长不良，活力降低，养分吸收量和物质运输减少，影响番茄正常生长发育（刘玉凤 等，2017）。植物中的miRNA 可以通过激素（如ABA、IAA）信号途径参与响应低温胁迫。低温胁迫下，番茄中miR162表达上调，相应靶基因表达量下调，进一步序列分析发现其启动子中含有低温响应元件，表明miR162依赖ABA 信号调节靶基因响应低温胁迫（王孝，2017）。与之相似的，低温诱导下番茄中miR167的表达量升高，且表达量越高番茄抗冷性越强（郭鹏 等，2014）。对过表达ShamiR319d的番茄分别进行低温胁迫和高温胁迫处理后发现，相较于野生型，突变体的叶片枯萎程度更低，PS Ⅱ光抑制更弱，过氧化物积累更少，活性氧清除系统活性更高，说明Shami319b扩大了番茄对温度的适应范围（Shi et al.，2019）。Cao 等（2014）通过高通量测序筛选出397 个对低温胁迫响应的miRNA，其中miR167、miR169、miR172、miR397和miR393在冷胁迫早期均被激活，尤其是miR172表达量最高，再利用降解组测序进一步预测相应靶基因，功能分析发现多数靶基因在低温应答中发挥积极作用，为进一步研究miRNA 及其靶基因响应番茄低温胁迫机理提供了有力支持。

2.1.2 高温胁迫 随着全球温室效应的加剧，高温对植物生长和生产带来的影响日益严重，尤其在夏季，高温已成为番茄栽培的常见胁迫因素，影响植株正常生理生化反应、营养物质的运输和积累，降低产量和品质。高温处理2 d 后，番茄植株中miR398a-5p、miR395a、miR398b-3p、miR397-5、pmiR160a-3、pmiR162a-5p和miR156 e-3p表达量显著下调；花中miR393-5p和miR160a表达水平分别与靶向的生长素受体SlTIR1和SlARF10/16的表达呈负相关，表明miR393-5p/SlTIR1和miR160a/SlARF10/16裂解级联反应被热激活，以调控雄蕊和雌蕊的发育来应对高温胁迫（Pan et al.，2017）。高温处理后，番茄植株中SlymiR171d的表达量显著上调，相应靶基因SCL6表达量则显著下调，表明高温诱导SlymiR171d表达以提高番茄的高温耐受性（Zhou et al.，2020）。植物高温胁迫抗性是通过多种相关转录因子相互作用调节的，其中NF-YA受miR169调控（Chen et al.，2012a）。分析番茄miR169 家族对不同高温胁迫（基础高温、驯化应激、后天高温）机制的响应，发现16 个miR169基因中有10 个在3 种胁迫条件下都上调，表明其对番茄耐热性至关重要（Rao et al.，2020）。Pan 等（2017）通过GO 和KEGG 分析发现，差异表达番茄miRNA 的预测靶基因在雌蕊和雄蕊代谢通路中均显著富集。Zhou 等（2016）对正常、渐进、急性升温处理下的番茄叶片进行高通量测序和降解组分析，分别鉴定出96 个和150 个响应渐进升温和急性升温的miRNA。在渐进升温处理1 h内，SpimiR159表达量显著升高，处理4、8、24 h后均显著降低；在急性升温处理1 h 和48 h 后，SpimiR168a-5p和SpimiR171d相较于对照表达量均显著降低，SpimiR159表达量显著升高。在拟南芥中过表达Hsp70显著增强植物耐热性，番茄中SpimiR6300_gma和SpimiR166c-3p分别靶向Hsp70和Hsp60-3A，进一步说明miRNA 参与番茄高温胁迫响应（Zhou et al.，2016；Pan et al.，2017）。

2.2 干旱胁迫

干旱胁迫是植物生长发育中常见的胁迫之一，干旱使植物细胞脱水，细胞膜相变，酶和蛋白质活性下降，影响气孔开合，导致光合速率降低、代谢失调等（陶文文，2011）。干旱胁迫下番茄叶片生长受抑，暗反应速率下降，活性氧含量过高，细胞膜结构损坏。miR160、miR165、miR166、miR171、miR398、miR408、miR827、miR9472、miR9476和miR9552等靶向关键干旱和组织发育相关基因，参与番茄对干旱的响应。干旱胁迫处理下，SlymiR403-3p和SlymiR845a-3p在敏感型番茄中下调，在耐旱型番茄中上调，SlymiR5512a和SlymiR9559-5p表达模式则与之相反（Candar-Cakir et al.，2016）。在番茄中过表达miR169c，发现miR169c通过转录后调控蛋白调节气孔孔径提高了番茄干旱耐受性；同样，miR169o在干旱胁迫下也表现为正调控（Zhang et al.，2011；Liu et al.，2017b）。生物信息学分析发现miR482a前体基因上游含有与干旱调控有关的顺式作用元件，干旱处理后miR482a的表达量呈先下降后上升的趋势，相反，其靶基因表达量呈现先升高后降低的趋势，存在明显负调控关系，说明miR482a通过调控其靶基因参与番茄抗旱响应过程（杨广磊，2017）。构建数据库进行分析，约有150 种miRNA 在干旱处理下差异表达（Liu et al.，2017b）。进一步研究发现，干旱诱导后，番茄中miR858及其靶基因的表达量在处理24 h 后有变化且最高；SlymiR166c-5p和SlymiR-429表达量显著下降，对应靶基因的表达量增加（沈洁，2015；Liu et al.，2018）。MYB 转录因子对植物抗逆性有一定的调节作用，且这种作用具有一定的广谱效应。李芳（2016）在进行SlyMYB7-like的抗旱性功能研究时发现，miR828作为SlyMYB7-like的上游基因，很可能在水分胁迫中通过调节其靶基因的表达来调节植物抗旱性。在不同干旱耐受性的番茄中，SlymiR156、SlymiR1919表达量上调，SlymiR9474表达量下调；SlymiR396和SlymiR397的靶基因可编码干旱胁迫相关蛋白酶，如半胱氨酸蛋白酶；SlymiR-149 和SlymiR-954 仅在干旱胁迫处理后的样品中被检测到，被认为是干旱特异性miRNA，并首次鉴定出参与番茄干旱响应的SlymiR1919、SlymiR5300和SlymiR9477，表明miRNA 可能是番茄抗旱的重要调节器（Liu et al.，2017b）。干旱胁迫下，番茄中SlymiR156 a表达明显上调，其SPL 靶基因应激响应后下调，植株表现出更好的干旱耐受性（Cui et al.，2014；Liu et al.，2017b）。

2.3 矿质营养胁迫

磷元素是植物生长发育所需的大量元素之一，但土壤中有效磷含量却仅有2～10 μmol·L-1。磷在光合作用、糖代谢、酶促反应中都有十分重要的作用，很大程度上决定作物的产量和品质（孙海国 等，2001）。磷在番茄坐果期发挥重要作用，缺磷严重影响番茄坐果率和果实的风味甜度。miR399 是第1 个被证明在番茄响应低磷胁迫中上调的miRNA，经验证ubc24是miR399的靶基因，且在响应低磷胁迫时表达量下调，符合miRNA 负调控靶基因的机制（Allen et al.，2005；于新超，2016）。番茄在磷饥饿诱导下，miR837-3p主要在根中表达并呈上升趋势，且表达量越高磷吸收能力越强，抗逆性越强，而在叶中表达量下调，推测miR837-3p在根中的高表达有助于植株从环境中吸收更多的磷元素以维持自身正常生长（于新超，2016）。番茄低磷处理下，miR164的表达水平始终低于对照组，与之互补的NAC1（促进侧根形成和发育的转录因子）表达趋势相反，表明miR164表达量降低是NAC1 表达水平提高的重要原因，且有助于番茄形成大量侧根，提高对磷元素的吸收能力（曾后清 等，2010）。

钾元素也是植物生长发育所需的大量元素之一，具有参与植物蛋白质合成、控制细胞膜极化、参与渗透调节、促进植物光合作用等功能，显著增强植株抗逆性。低钾胁迫会严重限制番茄生长发育和果实形成，造成减产。番茄能感受环境低钾信号并通过一系列信号转导途径作出相应的生理生化反应来适应低钾胁迫，以维持自身正常的生长发育。低钾处理下，miR168a在耐低钾型番茄中的表达量显著升高，处理5 d 后与对照组相比，其表达量提高了4.8 倍，说明在耐低钾型番茄中miR168 a参与调控钾离子转运机制，利于植株更好地适应低钾环境，提高抗逆性（刘杨，2018）。进一步研究发现，过表达miR168的植株表现出对逆境更强的适应性，如根毛伸长、叶绿素含量增加、钾离子含量提高等，证明miR168有助于番茄在低钾胁迫下维持正常生长发育（Liu et al.，2020）。赵晓明（2018）筛选了低钾处理下差异表达最显著的miRNA，得到miR156d-5p，并测得低钾胁迫下SPL3表达量下降，推测番茄miR156d-5p通过介导mRNASPL3靶向基因的剪切降解参与响应低钾胁迫。程欣（2020）通过测序发现，miR319b在钾离子不同耐性的番茄中表达水平差异极显著，过表达miR319b转基因植株低钾处理下根系生长受到明显抑制。

2.4 盐胁迫

盐碱土的广泛分布令盐碱胁迫成为农业生产中的又一大技术难题（胡延飞，2015）。过多的盐分配合其他不良环境条件导致番茄生长出现一系列生理生化障碍，如光合作用受损、离子毒害、渗透胁迫、活性氧产生和清除机制失衡等。盐胁迫下，番茄中SlymiR482e-5p的表达显著下调，对潜在的靶基因编码盐胁迫相关的GARS、CBF 转录因子，表明其参与番茄盐胁迫应激反应（Chen et al.，2012b；Zhao et al.，2017a）。盐胁迫可诱导盐敏感型番茄M82 中SlymiR390b-3p、SlymiR477-5p、SlymiR5300和SlymiR172b的差异表达。番茄中许多编码应激相关蛋白的基因可能是miRNA 的靶基因，受到SlymiR164b-3p、SlymiRn25a、SlymiR5300和SlymiR390b-3p等调控以提高番茄耐盐性（Zhao et al.，2017a）。盐胁迫下，胞质Ca2+增加，SlymiR164b-3p、SlymiR167b-3p、SlymiR9472-3p和SlymiRn86a可能通过参与钙离子稳态调节响应番茄盐胁迫（庞明利，2008；Nath et al.，2016）。

miR397a过表达番茄植株盐胁迫处理后，体内PPO、SOD 和POD 酶活性降低，且种子萌芽率和根长降低，说明miR397a在番茄响应盐胁迫机制中起负调控作用（庞明利，2008）。NaCl 胁迫下番茄叶和根中miR398a/b与其靶基因CSD表达量均上调，但在茎中miR398a表达量下调，推测可能是由于CDS调控有多种路径，盐胁迫对miR398的诱导是综合性作用（胡延飞，2015）。Zhao（2017a）建立了番茄盐胁迫下miRNA 文库，鉴定出95 个保守miRNA 和254 个新miRNA，其中有14 个保守miRNA 和109 个新miRNA 在盐胁迫下与野生型相比表达量出现显著差异。

2.5 光照胁迫

番茄是喜光性作物，一定范围内光照越强光合作用越旺盛。红光和蓝光是植物光合色素吸收的主要光谱，在植物生长发育过程中发挥重要作用（杨亚娜 等，2019）。不适宜的光照会导致番茄植株矮小，叶片减少，光合作用减弱，花期延迟，甚至引起番茄体内IAA 分解，严重影响植株正常生长发育（杨晖 等，2004；倪迪安 等，2014）。Dong等（2020）对番茄进行蓝光处理后筛选出20 个差异表达的miRNA，进一步研究发现，随机选取的10 个靶基因表达模式与相应miRNA 的表达模式相反，蓝光处理中下调的靶基因其相应miRNA 的表达量上调，经KEGG 富集分析发现，植物激素信号转导通路含有许多miRNA 相应的靶基因且明显富集，推测miRNA 及其靶基因参与激素信号传导以调节植物对不同光质的适应性。此外，有研究发现水稻中miR156、miR159、miR165、miR166、miR167、miR169、miR172等miRNA 均参与紫外线辐射胁迫，这些miRNA 在番茄中也已被鉴定，且属于高保守度的家族，推测其在番茄中也可能同样参与响应紫外线辐射胁迫（王孝，2017）

2.6 低氧胁迫

低氧环境会抑制植物的有氧呼吸，破坏植物正常的生理代谢，降低光合速率，关闭气孔，减弱蒸腾作用和活性氧代谢能力，进而抑制植株生长发育（肖明敏 等，2020）。低氧处理下番茄根部差异表达的miRNA 中，多数miRNA 如SlymiR159、SlymiR162、SlymiR482b等表达量下调，而SlymiR160b、SlymiR399、SlymiR9472-3p等表达上调，检测相应的靶向mRNA 在番茄根部均有较高表达量，符合miRNA 负调控靶基因的机制；利用STTM 抑制番茄植株中缺氧下差异表达的miR171和miR390，发现与正常处理的同龄番茄相比，缺氧条件下转基因植株的侧根更多更长；此外，miR166和miR482在缺氧条件下的番茄根中表达量较低，表明其在番茄缺氧响应中发挥作用（Hou et al.，2019）。

3 展望

miRNA 作为近年来分子生物学领域的新兴研究热点，在植物生长发育过程中起重要作用。miRNA 是短的单链分子，通过形成RNA 诱导沉默复合物结合在靶向mRNA 上，对其进行切割或翻译抑制进而调节基因表达。研究表明，番茄中大量miRNA 可以参与响应非生物胁迫。miRNA 在番茄响应非生物胁迫中的调控作用为进一步研究番茄抗逆性提供了新的参考，也为其他miRNA 的相关作用机制研究提供了新的思路。虽然在miRNA 及其靶基因的预测方面已经有了比较成熟的技术支持，且miRNA 及靶基因在植物抗逆性、激素调控、器官分化等方面的功能有了大量的研究发现，但还存在一定局限性。同一种miRNA 结合不同的AGO蛋白形成的RISC 对同一个靶基因的调控是否会有所不同，miRNA 在组合型胁迫下如何发挥作用，同种miRNA 在不同植物中作用机制有何差异等，这些都有待进一步深入研究。