利用含5BS·7BS/5BL·7BL易位的重组自交系创制小麦染色体结构变异新材料

杨漫宇,王 琴,唐宗祥，杨恩年*

(1.四川省农业科学院作物研究所/农业农村部西南地区小麦生物学与遗传育种重点实验室，四川 成都 610066；2.四川农业大学农学院，四川 成都 611130)

【研究意义】小麦(TriticumaestivumL.，AABBDD，2n=6x=42)作为人类最重要的口粮，是世界上种植面积最大的粮食作物之一。近年来，审定并推广的小麦品种所用亲本往往集中在少数几个骨干亲本，品种的遗传背景逐渐单一，品种间同质化现象日趋明显，导致其抗病虫害、抗逆性的能力严重下降[1]。2019—2020年的四川省小麦区试中，由于条锈病生理小种发生了变化，往年抗病的骨干亲本川麦104 及其衍生品种都表现为感病。因此，拓宽遗传基础是突破当前小麦育种水平的关键因素。而利用小麦-异源易位染色体和小麦自生易位染色体进行小麦育种，是拓宽小麦遗传变异的重要途径之一[2]。【前人研究进展】据报道，许多欧洲小麦品种含有5BS·7BS/5BL·7BL相互易位染色体，这对相互易位染色体是小麦5B和7B染色体断裂重组而成，研究发现该易位染色体的抗白粉病、抗条锈病以及对欧洲气候的适应性等优良特性使得它们广泛存在于欧洲小麦品种中[3-4]。利用携带5BS·7BS/5BL·7BL相互易位染色体的材料培育出含该相互易位染色体的优良小麦品种在四川还比较少，目前只有四川省农业科学院作物研究所小麦新材料课题组成功培育出了新品种，如：川麦55[5]、川麦62[6-7]和川麦88(未发表数据)。表明染色体易位重组能产生有益性状，为小麦育种改良提供新的遗传变异。而荧光原位杂交是用于研究小麦及其近缘种属染色体结构变异的有效方法。尤其是近年来发展起来的基于寡核苷酸探针的非变性荧光原位杂交(non-denaturing florescence in situ hybridization,ND-FISH)技术，可以快速、准确和规模化检测小麦染色体的结构变异。Tang等[8]和Fu等[9]开发了可用于ND-FISH检测的寡核苷酸探针Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2，这2种探针的结合取代了重复DNA序列pSc119.2和pTa-535的作用，成功鉴定了普通小麦的21条染色体。Jiang等[10]以Oligo-pSc119.2-1,Oligo-pTa535-1和Oligo-(GAA)6作为探针进行ND-FISH分析，对83份1RS.1BL易位品种(系)、1份小麦-黑麦1RS·1AL易位品种Amigo和普通春小麦中国春的染色体结构进行了研究。Liu等[11]利用ND-FISH技术评价了76个具有代表性的小麦主产区品系的遗传多样性。因此，相较于传统FISH检测的费时费力，ND-FISH技术简便，可用于小麦染色体的高通量鉴定。【本研究切入点】小麦品种川麦42和川麦55由四川省农业科学院作物研究所选育，分别于2004和2009年审定。川麦42为人工合成小麦，川麦55除了含有5BS·7BS/5BL·7BL相互易位染色体外，还含有小麦-黑麦1RS.1BL易位染色体[5]。1RS·1BL易位染色体含有一系列优异基因，被广泛应用于小麦育种[12-13]。【拟解决的关键问题】为了更好地将5BS·7BS/5BL·7BL相互易位染色体应用于小麦育种，本研究利用高通量的ND-FISH技术对来自川麦42×川麦55的高代重组自交系F6群体进行鉴定，分析5BS·7BS/5BL·7BL相互易位对后代染色体的影响及对农艺性状的影响，以期为这对易位染色体在育种和生产中的应用提供指导。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本研究以小麦品种川麦42为母本，川麦55为父本进行简单有性杂交，再通过单粒传法构建高代重组自交系，获得包括200个株系的F6RIL群体。

1.2 ND-FISH分析

分别对亲本川麦42、川麦55和来自于川麦42/川麦55杂交组合的200个F6RIL株系进行ND-FISH分析，每个材料选取5粒种子。种子萌发、根尖预处理、固定以及染色体制备参照Han等[14]描述的方法。寡核苷酸探针Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pTa535-1和Oligo-(GAA)7由上海英骏生物技术有限公司合成，序列详见表1，具体标记按照 Tang 等[8]描述的方法。分别在探针Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pTa535-1和Oligo-(GAA)7的5′端用6-carboxyfluorescein(6-FAM)、6-carboxytetramethylrhodamine(Tamra)和cyanidin 5(Cy5)进行标记。非变性原位杂交(ND-FISH)程序参照Fu等[9]描述的方法。染色体用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)进行染色，使用德国徕卡荧光显微镜DM4B进行图像采集。

1.3 农艺性状及田间抗条锈病调查

条锈病抗性鉴定：2017年在成都市新都区四川省农业科学院现代农业科技创新示范园种植川麦42、川麦55及其RIL群体。试验采用随机区组设计，2次重复，每个株系种植1行，行长1.5 cm，行距25.0 cm。采用条锈病生理小种条中30号、条中31号、条中32号及水源11的混合菌种接种诱发材料川育12，菌种由甘肃省农科院植物保护研究所贾秋珍提供，待充分发病时记载严重度。

表1 寡核苷酸探针序列

农艺性状调查：2018年在相同地点采用相同的种植方式进行农艺性状调查。出苗后匀单株；苗期进行化学除草，中后期施药防治蚜虫和条锈病；成熟后，每个株系随机收获5个单株进行株高、分蘖、小穗数和千粒重测定。

2 结果与分析

2.1 亲本核型分析

以Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1寡核苷酸探针对亲本川麦42(CM42)和川麦55(CM55)根尖有丝分裂中期染色体进行ND-FISH分析，建立标准核型，便于后代中各染色体的识别。川麦42含有正常1B、5B和7B染色体(图1-A、图1-B)，川麦55含有1RS·1BL和5BS·7BS/5BL·7BL易位染色体(图1-C、图1-D)。此外，双亲的5A、3B、3D和4D染色体存在差异(图1-B、图1-D)。5ACM42染色体不含Oligo-pSc119.2-1探针信号带，5ACM55染色体长臂和短臂各含1条Oligo-pSc119.2-1探针信号带；3BCM42染色体短臂末端含有1条Oligo-pSc119.2-1探针信号带，3BCM55染色体短臂末端含2条Oligo-pSc119.2-1探针信号带；3DCM42染色体短臂末端含有1条较强的Oligo-pSc119.2-1探针信号带，3DCM55染色体短臂末端不含该信号带；4DCM42染色体长臂末端含有较强的Oligo-pTa535-1探针信号带，4DCM55相同位置不含该信号带。

2.2 易位染色体分布及染色体结构变异事件

每个自交系随机选取5粒种子利用Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1寡核苷酸探针进行ND-FISH分析。200个自交系中，15份无鉴定结果，剩余185份根据1RS·1BL和5BS·7BS/5BL·7BL易位染色体的有无进行统计，纯合株系共142份含4种类型：1B和5B/7B(图2-A)、1RS·1BL和5B/7B(图2-B)、1B和5BS·7BS/5BL·7BL(图2-C)、1RS·1BL和5BS·7BS/5BL·7BL(图2-D)，分别含有43、30、35和32个株系(表2)。此外，还发现2个含变异染色体的株系17y456和17y588。17y456和17y588两者染色体数目均为2n=42，在遗传上已经稳定。株系17y456除了含有川麦55中的1RS·1BL，5BS·7BS/5BL·7BL易位染色体，还发现3B和5A相互易位染色体，即3BS·5AS/3BL·5AL易位染色体(图3)。株系17y588含有5BS·7BS/5BL·7BL易位染色体以及1对结构变异的4DChanged染色体，与双亲的正常4DNormal染色体相比，该4DChanged染色体的长臂末端出现了极强的Oligo-pSc119.2-1绿色信号(图4)。

2.3 易位染色体对农艺性状的影响

为评价1RS.1BL、5BS.7BS/5BL·7BL易位染色体对农艺性状的影响，研究对142份纯合株系的株高、分蘖、小穗和千粒重进行统计分析。4种类型株系的株高、分蘖、小穗数和千粒重在0.05水平上均没有显著差异(表2)。说明，1RS·1BL、5BS·7BS/5BL·7BL易位染色体对株高、分蘖、小穗数和千粒重没有不良影响。

表2 不同染色体类型对农艺性状的影响

表3 含染色体结构变异的株系与亲本川麦42和川麦55的农艺性状比较

比较2份含染色体结构变异的株系与亲本川麦42和川麦55的农艺性状(表3)，发现17y456的株高90.40 cm，与川麦42(88.00 cm)没有显著差异，但显著高于川麦55(77.60 cm)；分蘖数5.00个，显著低于川麦42(9.60个)和川麦55(10.20个)；小穗数20.40个，与川麦42(19.60个)没有显著差异，显著低于川麦55(22.80个)；千粒重50.20 g，显著低于川麦42(61.60 g)，显著高于川麦55(44.20 g)。17y588的株高53.60 cm，显著低于川麦42和川麦55；分蘖数9.60个，与川麦42和川麦55没有显著差异；小穗数20.80个，与川麦42无显著差异，显著低于川麦55；千粒重40.20 g，显著低于川麦42和川麦55。此外，17y456和17y588的条锈病严重度分别为5和0，高抗条锈病，显著低于亲本川麦42和川麦55的严重度100和20，在条锈病抗性方面得到了显著性提高和改善。综上，17y456和17y588中的染色体结构变异对产量相关性状无明显的不良影响，但高抗条锈病，可以应用于小麦抗病育种改良。

3 讨 论

5BS·7BS/5BL·7BL相互易位染色体在20世纪60—70年代普遍存在于西欧小麦中,如Bersee和Cappelle-Desprez[15]。Badaeva等[4]对来自欧洲、亚洲及美国等37个国家的460份小麦和39份小黑麦材料进行分析，发现9份法国面包小麦品种携带了5BS·7BS/5BL·7BL相互易位染色体。在来自于英国小麦基因库的538个小麦株系中，66%的材料含有5BS·7BS/5BL·7BL相互易位染色体[16]。另外，Badaeva等[4]提到其他学者至少鉴定了16个携带了这对易位染色体的小麦品种。有学者认为，5BS·7BS/5BL·7BL相互易位的5BS染色体臂上携带的条锈病成株抗性基因[3,17]及其对欧洲气候的适应性[4]是该相互易位染色体普遍存在于西欧小麦中的重要因素。杨漫宇等[5-6]和Hu等[7]报道了四川小麦品种川麦62、川麦55和川麦88(未发表数据)也携带5BS·7BS/5BL·7BL相互易位染色体。Hu等[7]认为，除了欧洲环境，5BS·7BS/5BL·7BL相互易位染色体也适应四川的生态环境，这对易位染色体在四川小麦育种改良中具有较大的潜力。此外，在川麦42×川麦55的F6RIL群体中，还发现含1RS·1BL，5BS·7BS/5BL·7BL和3BS·5AS/3BL·5AL易位染色体的多重易位系材料17y456以及含5BS·7BS/5BL·7BL和4DChanged染色体的材料17y588。此前，笔者曾报道了含有3BS·5AS/3BL·5AL易位的新材料，但是该材料还携带了6VS·6AL和5BS·7BS/5BL·7BL易位[6]。Hu等[7]在“内麦”系列品种中也检测到了3BS·5AS/3BL·5AL易位染色体。这些材料与本研究中的17y456均不同。关于本研究中的4D染色体变异，在前人研究中还未见报道。表明，17y456和17y588是含多重易位系的新材料。由于5B 染色体长臂上携带了强效配对抑制基因Ph1[18]，能够抑制部分同源染色体配对，因此笔者推断5BS·7BS/5BL·7BL相互易位染色体很有可能是川麦42×川麦55的F6RIL群体后代中出现染色体结构变异的诱因，但诱导变异形成的机制有待于研究。

5BS·7BS/5BL·7BL易位染色体虽然已被广泛应用于小麦育种[3-4,15]，但这对易位染色体对农艺性状的影响还未见相关报道。本研究通过对1B和5B/7B、1RS·1BL和5B/7B、1B和5BS·7BS/5BL·7BL、1RS·1BL和5BS·7BS/5BL·7BL 4种类型株系的农艺性状进行评价，发现4种类型株系在株高、分蘖、小穗数和千粒重上没有差异，说明RS·1BL、5BS·7BS/5BL·7BL易位染色体对株高、分蘖、小穗数和千粒重没有不良影响。除了抗病性和适应性，对农艺性状无负作用可能是5BS·7BS和5BL·7BL易位染色体能够成功应用于小麦育种改良的另一个重要因素。研究还发现，多重易位系17y456和17y588在分蘖、小穗数和千粒重3个产量性状上与亲本相比无明显不良影响，但是高抗条锈病，与亲本相比得到了显著的改良和提高。表明多重易位染色体在这2个株系中达到了协调，这些材料为今后研究小麦染色体变异协调的机制提供了材料基础。前人研究证明，多重易位系具有良好的抗病性或优异的农艺性状特性，这与本研究结果一致。例如：小麦-黑麦-簇毛麦三重易位系(1RS·7DS，1BL·7DL，6VS·6AL)具有良好的农艺性状和白粉病抗性[19]；小麦-黑麦三重易位(5BS·7BS，5BL·7BL，4BL·5RL)对微量元素铜具有高效利用率[20]；小麦-簇毛麦三重易位(6VS·6AL、5BS·7BS和5BL·7BL)和五重易位系(6VS·6AL、5BS·7BS、5BL·7BL、3BS·5AS和3BL·5AL)具有高产、高抗条锈病和白粉病的优良特性[6]。因此，小麦染色体多重易位是拓宽小麦遗传变异的有效途径，可以作为今后小麦育种及种质创新的一个方向。

有性杂交除了引起基因组结构重排，还可引起表观遗传变异，与基因表达活性密切相关，有助于新的基因表达，有利于增加其抗性、产量和保持其物种稳定性[21-22]。本研究鉴定的多重易位系材料17y456和17y588田间锈病严重度分别为5和0，表现为高抗条锈病，与亲本相比在条锈病抗性方面得到了显著提高。因此，笔者推断其抗病性优于双亲的原因可能是川麦42和川麦55有性杂交过程中发生的基因组重排，引起遗传或表观遗传的变异，最终导致亲本中不表达的抗病基因被激活，表现出抗病性。说明多重易位系材料17y456和17y588是育种和进行理论研究的好材料。

4 结 论

1RS·1BL、5BS·7BS和5BL·7BL易位染色体对株高、分蘖、小穗数和千粒重无负作用，这为育种家在应用易位系进行品种改良提供了指导意义。多重易位系17y456(1RS·1BL，5BS·7BS/5BL·7BL和3BS·5AS/3BL·5AL)和17y588(5BS·7BS/5BL·7BL和4DChanged)是高抗条锈病的新材料，丰富了小麦育种改良的物质基础。5BS·7BS/5BL·7BL易位染色体可以诱导产生染色体结构变异，这为今后小麦育种及种质创新提供了方向。