水稻抗白叶枯病基因Xa23分子标记的开发与应用

王闵霞,白玉路,张 琼,徐登武,张志勇,王 平

(四川省农业科学院生物技术核技术研究所，四川 成都 610066)

【研究意义】白叶枯病是水稻主要病害之一，经常在世界各籼稻区发生，通常会引起10%～30%的减产[1-3]。利用寄主自身对白叶枯病的抗性，不仅能提高水稻产量，还能减少因大量施用农药造成的环境污染。近年来，世界范围内开展了大量水稻抗白叶枯病基因的发掘和利用工作。截至2015年，经国际注册确认或期刊报道的水稻抗白叶枯病基因达40个，被成功克隆的有9个[4-5]，其中包括Xa23。Xa23来源于长药野生稻，对国内外鉴别菌系均表现出高抗性，且完全显性、全生育期抗病，在杂交稻的白叶枯病抗性育种中具有广阔的应用前景[2,6-8]。【前人研究进展】从被发现和定位开始，Xa23逐渐应用于水稻的白叶枯病抗性改良。赵开军等[2]以CBB23为供体创造了3个抗白叶枯和抗褐飞虱且农艺性状优良的恢复系C601、C627和C664。2008年广西省农业科学院将Xa23导入不同遗传背景的籼稻和粳稻，F1代达高抗水平；导入不育系后F1代达中抗水平。黎志康[9]利用Xa23改良水稻恢复系，得到改良材料明恢63-Xa23、YR293-Xa23和Y1671-Xa23三个恢复系材料及他们的组合全生育期高抗白叶枯病。周鹏、顾建强等[10-11]利用Xa23分别改良了水稻恢复系福恢2328和蜀恢527的白叶枯病抗性。实践证明Xa23在水稻白叶枯病抗性改良中基因效应明显[12]，具有较大的应用前景。截至2018年全国有50多家单位或个人引用携有Xa23基因的水稻抗病材料，并利用该基因培育出博优1652、龙两优237及超优千号等抗病水稻新品种15个以上[13]。Xa23位于水稻第11染色体长臂上。在Xa23的定位过程中，先后开发出不同的分子标记并用于水稻分子标记辅助育种中。2003年开发出的分子标记RM187、RM206、RpdH5、RpdS1184与Xa23遗传图距分别为7.1、1.9、7.0和7.6 cM[7]，罗小芬等[14]验证了RM206在育种材料中的多态性；王春连等[2]开发出与Xa23距离为0.8 cM的C189并用于育种实践；王春连等[15]通过对Xa23精细定位开发了与Xa23共分离的标记Lj74。由于遗传重组的发生，分子标记辅助选择的准确率与分子标记距离功能基因的远近呈负相关，同时利用位于功能基因两侧的标记可以提高检测的准确性，如潘海军[16]在利用Xa23改良育种材料抗病性时，利用RpdH5和RpdS1184辅助选择的准确率分别为91.0%和87.3%，同时使用2个标记时，准确率提高至99%。【本研究切入点】Xa23正越来越多地用于水稻抗白叶枯病育种中。由于用来鉴定Xa23基因的P6和P10引自国际水稻研究所(IRRI)，为强致病菌系，其接种鉴定受到严格的限制，因此在育种实践中，Xa23基因的分子标记辅助选择显得尤其重要。王春连等[17]清晰阐释了Xa23的作用机制，并揭示Xa23在抗病性材料CBB23与感病材料金刚30(JG30)、日本晴、牡丹江8号 (MDJ8)在Xa23启动子区的序列差异，这为开发位于Xa23基因内部的分子标记奠定了基础。【拟解决的关键问题】已有的Xa23基因分子标记均位于基因外侧，由于遗传过程中会发生交换和重组，因此应用单个分子标记会产生选择误差，应用两侧分子标记使得选择过程复杂，费工费力。为了提高Xa23基因分子标记的准确率和效率，本研究利用抗病水稻材料CBB23与感病材料金刚30(JG30)、日本晴、牡丹江8号 (MDJ8)及川恢907、川航恢908、川恢991、川恢992等的启动子区序列差异，开发出一个位于Xa23基因内部的标记，这不仅大大提高了分子标记辅助选择的准确性，还可通过简化检测步骤从而提升检测效率。

1 材料与方法

1.1 试验材料

CBB23来自于中国农业科学院作物科学研究所，含有Xa23基因，高抗白叶枯病为Xa23的供体。

川恢907、川航恢908、川恢991、川恢992，四川省农业科学院生物技术核技术研究所自育恢复系，综合性状优良，白叶枯病抗性差，为待改良白叶枯病抗性的水稻材料，即Xa23基因的受体。

1.2 引物设计

由长药野生稻转育的抗白叶枯病材料CBB23与感病材料JG30、日本晴、MDJ8在Xa23基因启动子区存在一段约156 bp的序列差异，除碱基不同外，抗病基因较感病基因还存在67 bp的碱基缺失。针对该区域序列，设计引物对CBB23和待改良材料川恢907、川航恢908、川恢991、川恢992进行测序，确认序列差异存在。利用Primer premier5设计引物，Xa23-F序列为CCCTGAGTCAAAGTCTTCCC，Xa23-R序列为CAGAGAGGAAGTGCTTGCAG。该标记为显性标记，在含有Xa23的纯合及杂合单株中均能扩增到198 bp的片段，不含有Xa23的单株扩增不到片段。

1.3 PCR扩增及产物检测

用CTAB法提取或碱裂解法快速提取植物基因组DNA，调整DNA浓度至50～500 ng/μL。配制10 μL PCR体系如下进行PCR扩增：DNA模板1 μL，Xa23-F(10 μmol/L)0.5 μL，Xa23-R(10 μmol/L)0.5 μL，1.1×T3 Super PCR Mix(擎科生物)8 μL。PCR程序为95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 Xa23分子标记的开发

据报道，白叶枯病抗性基因Xa23(来自CBB23)与感病基因xa23(来自日本晴、MDJ8)在启动子区存在较大序列差异(图1-A)[18]，起始密码子上游100～250 bp区间内，除序列不同外，Xa23还较xa23缺失67 bp。由于Xa23来自野生稻，栽培稻中不存在，因此本序列适宜作为Xa23的特征序列进行分子标记开发。设计引物扩增该特异片段，含有Xa23的单株或群体能够扩增到长度为198 bp的片段，反之则不能。

分别以CBB23、川恢907、川航恢908、川恢991、川恢992的DNA为模板，利用Xa23-F、Xa23-R引物对进行扩增，结果如预期，CBB23中扩增到198 bp的特异条带(图2)，川恢907、川航恢908、川恢991、川恢992则没有扩增产物。测序结果显示，CBB23中扩增到的产物为CBB23特征片段(图1-B)。

该特征片段可用来辨别CBB23与川恢907、川航恢908、川恢991、川恢992的杂交后代中是否含有白叶枯病抗性基因Xa23，适宜用作上述恢复系的白叶枯病抗性改良标记。

2.2 Xa23分子标记的验证

为了检测分子标记在不同基因型的表现，以CBB23为阳性对照，川恢907、川航恢908、川恢991、川恢992为阴性对照，川恢907、川航恢908、川恢991、川恢992分别与CBB23的DNA等量混合后作为杂合体对照，PCR产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(图2)。本分子标记为显性标记，以阳性或杂合体对照DNA为模板均扩增到一条198 bp左右的亮带，阴性对照中则无对应的条带。

2.3 水稻重要种质材料Xa23基因型的鉴定

具有不同优良性状的亲本是水稻育种重要的材料基础和基因资源，了解其遗传背景对亲本的高效利用具有重要的指导意义。本研究对354个引自不同稻区的水稻亲本进行了Xa23基因背景鉴定，结果显示，除华航G528、R418、R419、R433、R440 5个材料含有Xa23外，其他亲本不含有Xa23抗性基因(表2)，与实验预期一致，因为Xa23来自于野生稻，并并非天然存在于栽培稻中。对从上述5个亲本中扩增到的PCR产物进行测序，确认为Xa23基因(图3)。这些含有Xa23基因的亲本材料均来自华南稻区，推测这是华南稻区较早开展Xa23基因利用研究的结果。

3 讨 论

随着生物技术的不断发展，分子标记辅助育种(MAS)正越来越广泛地应用于作物育种中，尤其在作物抗性改良、品质提升的精准化育种中表现出显著优势。优良的基因是实现MAS的前提，高效、准确的分子标记是进行MAS的关键。

白叶枯病是影响水稻生产的最古老、最严重的细菌病害之一，通常会引起大幅度减产甚至造成颗粒无收。虽然报道的白叶枯病抗性基因至今有40个，但由于抗谱窄，或为隐性基因不好利用等原因，这些基因被应用于育种实践的很少。Xa3、Xa4曾经在水稻白叶枯病抗性育种中发挥了重要作用，但随着时间的推移，它们渐渐对病害失去了抗性。Xa21是一个抗病谱较广的基因，在水稻抗白叶枯病育种中有一定的应用。章琦等[7]从野生稻中定位克隆了Xa23，这为水稻白叶枯病的防治提供了新的基因资源。Xa23与Xa21具有相似的抗谱，但它比Xa21表现出更大的优势，它对国内外所有鉴别菌系均表现为高抗，而且全生育期抗性、完全显性，导入效应明显。至今，Xa23在水稻白叶枯病抗性改良中应用最广泛且具有最广阔的应用前景。

表1 Xa23基因在F2群体中的分离情况

表2 部分重要水稻种质材料Xa23的鉴定结果

在Xa23的定位与克隆过程中，陆续开发了一些分子标记并应用于水稻抗白叶枯病育种中。这些标记与Xa23基因具有一定的距离，利用这些标记进行基因型检测时会产生一定的误差，为了提高检测的准确性，有时候会利用位于基因两侧的两个标记同时检测，这使得检测步骤繁琐，耗时、耗力。本文根据Xa23抗性基因启动子区的特征序列开发的分子标记扩增效率高，与基因共分离，仅通过该标记即可确定是否含有Xa23，这不仅提高了检测的准确率，还通过简化检测步骤提高了检测效率。

由于遗传重组的发生，利用分子标记鉴定基因型的准确率与该标记与功能基因的距离呈负相关。郑康乐等[18]认为，用于MAS的分子标记与目标基因的遗传距离最好小于5.0 cM。通过比较和验证，王春连等[2]提出分子标记与目标基因的遗传距离在1.0 cM以内较为可靠。位于基因内部的分子标记与基因零距离、与基因共分离，因此准确率最高。另外，分子标记在基因供体与受体间存在多态性是实施MAS选择的前提之一，无多态性的标记则无法使用。理论上讲，针对基因内部特异序列开发的分子标记无需进行亲本多态性分析即可应用，且通用性更高。

本研究开发的是一个位于Xa23基因内部的显性分子标记，仅利用本标记即可对Xa23进行基因型鉴定，快速筛选掉不含Xa23的单株，准确率达100%。这充分体现了分子内标记的优势。在针对Xa23特征区域设计标记时，笔者设计了不同的引物，预期扩增片段为100～500 bp，可区分纯合Xa23、xa23及Xa23/xa233种基因型，由于该区域编码序列差异较大，设计的几对引物均未能扩增到xa23对应的片段。由于不能区分Xa23的纯合或杂合型，本文开发的标记在应用中有一定的局限。笔者后期将继续针对该区域或其他位点开发新的共显性分子标记等，以便为Xa23进一步的高效利用提供技术参考。

4 结 论

本研究针对抗白叶枯病材料CBB23与感病材料JG30、MDJ8、川恢907、川航恢908等在Xa23基因启动子区存在序列差异和缺失，开发了一个位于Xa23基因启动子区的分子内标记。该分子标记为显性标记，在阳性或杂合体中能扩增到198 bp的特异性PCR产物，阴性材料中则无特异性扩增。利用该标记对354个引自不同稻区的水稻亲本进行Xa23基因型鉴定，发现5个材料包括华航G528、R418、R419、R433、R440含有Xa23基因，其他亲本不含有Xa23基因。该分子内标记不仅提高了分子标记辅助育种的准确性，还通过简化检测步骤提升了检测效率。本标记的开发可为Xa23的高效利用提供技术参考。