不同贮存年份普洱生茶中3种主要黄酮醇类化合物含量的变化

张纪伟，沈雪梅，赵一帆，王 玮，张 钎，周艺凡，李家华*

(1.云南农业大学龙润普洱茶学院，云南 昆明 650201；2.昆明市农业科学研究院，云南 昆明 650201)

【研究意义】黄酮类化合物(Flavone，也称花黄素)是广泛存在于自然界的一类水溶性黄色色素，主要类型有黄酮、黄酮醇、双黄酮等。茶叶中的黄酮醇及其苷类的含量约占茶叶干物质的3%～4%，是茶汤的重要呈色和呈味物质。黄酮类化合物具有改善血液循环、抑制炎性生物酶渗出、降低胆固醇、促进伤口愈合和调节心血管系统等生理功能[1]，黄酮类化合物也是一种很强的抗氧化剂，可以有效清除体内的氧自由基和降低细胞氧化损伤程度[2-3]。【前人研究进展】普洱茶是云南所特有的地理标志产品，近10年来随着普洱茶热的兴起，普洱茶“越陈越香”品质特点的生物化学基础及功效已被广大研究者所关注，其中在黄酮类化合物的研究方面：罗龙新[4]等研究证明了云南普洱茶中黄酮类化合物含量与品质有密切关系；李家华等[5]研究了普洱茶发酵过程中黄酮醇类物质含量的变化，并对黄酮醇类物质的含量与品质的形成作了讨论分析；Toyoda等[6]研究发现普洱熟茶中儿茶素等含量很少，但有杨梅素等黄酮物质存在；关文玉等[7]对普洱熟茶中黄酮醇类物质杨梅素、槲皮素、山奈酚开展了分离纯化研究。郭刚军等[8]认为普洱茶中富含的黄酮类化合物是普洱茶药理作用的主要活性成分之一，芦丁、槲皮素及山奈酚等是普洱茶中具代表性的黄酮类物质；王丽等[9]对2个不同贮存年份普洱熟茶和普洱生茶中黄酮类化合物含量进行测定，发现其含量可以作为贮存年份的判别指标。【本研究切入点】迄今为止，从普洱茶贮存年份对黄酮醇类单体化合物含量变化、及其对品质影响的研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】以同一地区，同一厂家不同贮存年份(2006—2015年)普洱生茶标准样为供试样，利用HPLC法测定了供试样中芦丁、杨梅素、槲皮素和山奈酚成分的含量，分析其含量变化的原因，并以其中的杨梅素、槲皮素、山奈酚及黄酮总量为指标，进行聚类分析。旨在探明不同贮存年份普洱生茶中黄酮醇类化合物含量变化的趋势，为普洱生茶的年份鉴别和对普洱茶“越陈越香”理论的构建提供一定的数据及理论支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料与仪器

供试茶样：不同贮存年份(2006—2015年)普洱生茶(七子茶饼，生产企业标准样，规格：357 g)，由云南双江勐库茶业有限责任公司提供。黄酮醇类化合物标品：杨梅素、槲皮素、山奈酚、芦丁(纯度≥98%)购于SIGMA 公司；高效液相色谱仪(HPLC)分析装置：美国Agilent 1200型高效液相色谱系统；TSK gel ODS-80TM色谱柱 4.6 mm×250 mm，5 μm，日本Tosoh 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 杨梅素、槲皮素、山奈酚和芦丁标准液的制备 分别精密称取杨梅素、槲皮素、山奈酚和芦丁标品适量，加甲醇制成每1 mL含0.3 mg的溶液，作为对照品溶液。精密吸取4种对照品溶液1 mL置10 mL的量瓶中，加甲醇至刻度，作为混合标准溶液(备用)。

1.2.2 样品待测液的制备 用水浴回流装置制备供试茶样溶液[10]。精确称取茶叶粉末1.00 g，加甲醇40 mL，盐酸4 mL，置于圆底烧瓶中回流水解1.5 h (85 ℃)，过滤，滤液置50 mL容量瓶，用少许甲醇洗涤残渣及容器，洗涤液并入容量瓶中，加甲醇定容至50 mL，摇匀，经0.45 μm有机系微孔滤膜过滤后进行色谱分析。

1.2.3 色谱条件 色谱柱。TSK gel ODS-80TM色谱柱。流动相。A 相：0.2%磷酸水溶液；B 相：80%甲醇水溶液，梯度从40%到90%，流速0.8 mL/min，40 min内完成，检测波长360 nm，柱温40 ℃，进样量10 μL，每次完成后系统平衡7 min 后再次进样。流动相 A、B均用0.45 μm的滤膜过滤，分析样都经孔径0.45 μm的滤膜过滤后进行HPLC检测。

1.2.4 结果计算 3种黄酮醇类化合物的含量的计算公式如(1)、(2)[11]：

(1)

式中，ωa.b.c为供试样中杨梅素(a)、槲皮素(b)、山奈酚(c)的含量，单位为mg/g；C1.2.3为标准曲线上查到的杨梅素、槲皮素、山奈酚的浓度，单位为mg/mL；V为样品的定容体积，单位为mL；m为试样的质量，单位为g。

ω=(ωa+ωb+ωc)×2.51

(2)

式中，ω为供试样中黄酮醇苷总量，单位为mg/g；2.51为苷元折算为黄酮醇苷元总量的系数。

1.3 数据处理

每个处理重复3次，采用Excel2017对所测数据进行整理、分析，采用SPSS 18.0进行显著性差异分析，用TBtools进行年限聚类分析，采用R 3.6.2进行Pearsons相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同贮存年份普洱生茶中3种黄酮醇类化合物含量的变化

从图1-A中可以看出，应用HPLC装置和色谱分析条件，可以对杨梅素、槲皮素和山奈酚3种黄酮醇类化合物进行有效分离，图1-B显示供试茶样中可以明显检测到杨梅素、槲皮素和山奈酚。从表1可知，在2006—2015年的贮存期间，3种黄酮醇类化合物含量及黄酮总量变化明显地有2个阶段，即在贮存时间相对较短的初期(2011—2015年)其含量变化相对平稳，但是到了贮存的后期其含量呈现出显著性(P<0.05)递增的趋势。如：杨梅素在2009—2015年的茶样中其含量没有显著性差异，但是从2007年(贮存年份为8年)的茶样开始其含量出现了显著性增加的趋势，2006年(贮存年份为9年)的茶样，其含量呈显著性增加，且达到最高值，为(3.19±0.28)mg/g；在2008年的试样中杨梅素含量最低，为(0.36±0.17)mg/g。槲皮素是3种黄酮醇类化合物中含量最高的，其含量的变化与贮存年份呈正相关，从2006—2010年期间随贮存年份的延长，其含量呈显著增加，2006年(贮存年份为9年)的茶样中含量达到(10.17±0.96)mg/g，是2015年茶样的4.48倍；从表1可知，所有茶样中山奈酚的含量变化随着贮存年份的延长，其含量的变化趋势与其他2种黄酮醇类化合物一样，开始几年(2011—2015年)变化相对平稳，但到了后期呈显著性递增的趋势。上述黄酮醇类化合物含量增加的原因可能是贮存过程中黄酮苷类受糖苷水解酶、水分、氧气、温度等条件的影响，黄酮醇苷经过水解反应脱去糖苷形成黄酮醇苷元所致[12]。

表1 不同贮存年份普洱生茶黄酮醇类化合物的含量

2.2 不同贮存年份普洱生茶聚类分析及年份鉴别结果

聚类分析是一种以收集数据的相似性为基础进行分类的方法。从获得的不同贮存年份普洱生茶中杨梅素、槲皮素和山奈酚3种黄酮醇类化合物和黄酮总量的数据为基础，通过聚类分析进行年份鉴别的可行性，研究结果如图2所示，不同贮存年份10个茶样可以聚为2大簇，其中第一个簇为2006—2008年的3份茶样，第二簇为2009—2015年的7份茶样。3种黄酮醇类化合物和黄酮总量的聚类结果为杨梅素、槲皮素和黄酮总量的贡献度比山奈酚大。由此可推测，不同年份茶样中黄酮醇类化合物含量作为普洱生茶年份鉴别的指标是可行的。

2.3 不同贮存年份普洱生茶黄酮醇类化合物与贮存年份之间的相关性分析

为进一步探究黄酮醇类化合物含量随着贮存年份的变化和各个贮存年份茶样之间的相关性，分别进行了Pearsons相关性分析，结果如图3、图4所示。黄酮总量、槲皮素和山奈酚三者之间存在的相关性最强；黄酮总量与杨梅素以及杨梅素与槲皮素之间的相关性次之；杨梅素与山奈酚之间相关性最弱。贮存年份越接近的茶样之间相关性越强，与聚类分析的结果相一致。

3 讨 论

研究表明，黄酮醇及其苷类是茶多酚的重要组分含量仅次于黄烷醇类，对茶叶感官品质、生理功能等起重要作用[13]。黄酮醇及其苷类物质多为亮黄色结晶，对绿茶汤色有较大影响。有关茶叶滋味品质，Susanne S等[14]研究黄酮苷类呈柔和感涩味(干燥的口感)，且阈值极低，是红茶中主要的涩味物质。宛晓春等[15]认为黄酮醇苷类脱去糖苷配基变成黄酮或黄酮醇，可以降低黄酮醇苷类物质的苦味，利于改善茶叶滋味品质。谌滢等[16]研究普洱生茶汤色随着陈化年份的延长，逐渐变深，整体呈现橙黄—黄橙—橙红—棕红的变化趋势。通过研究发现，随着贮存年份的延长，茶样中杨梅素、槲皮素和山奈酚的含量整体呈增加的趋势，后期呈显著递增的趋势，究其原因是在贮存过程中黄酮苷类与糖苷水解酶、水分、氧气、温度等条件有关，是黄酮醇苷经过水解反应脱去糖苷形成黄酮醇苷元所致[12]，在2008年供试样中杨梅素含量出现显著性变化与发生异构化有关。脱去的糖苷可以降解黄酮醇苷类物质的苦味，黄酮醇苷类物质的降解和黄酮醇类物质的增加，在感官品质上随着贮存年份的延长收敛性和粗涩感逐步减弱，而醇、厚、甘、滑的普洱生茶的陈茶特点会更加突显。

目前，不管普洱生茶或是熟茶的年份鉴别主要依据感官审评方法进行判别，但是受品评者的经验和主观性所限、以及样品的不同冲泡程度都会对感官审评的结果造成影响。为了克服经验性和主观性对年份鉴定带来的影响，Yang等[17]和罗美玲等[18]利用电子鼻技术分别对普洱生茶和熟茶进行香气判别和年份鉴定的研究，基于主成分分析(PCA)和聚类分析，能很好的区分不同年份的普洱茶(生、熟茶)，而基于黄酮醇类化合物含量的聚类分析对普洱生茶的年份鉴定也是可行的。

4 结 论

随着储存年份的延长，3种黄酮醇类化合物杨梅素、槲皮素和山奈酚含量及黄酮总量的变化可分成2个阶段，储存时间较短的初期其含量变化相对平稳，在储存的后期其含量呈现出显著性递增的趋势。聚类分析表明，不同年份普洱生茶茶样中黄酮醇类化合物含量及黄酮总量可以作为普洱生茶年份鉴别的指标。相关性分析结果表明，黄酮总量、槲皮素和山奈酚三者之间含量的变化相关性显著，贮存年份越接近的茶样之间相关性越强。