野外繁育蝉花菌株的筛选及分子标记分析

谭悠久，龙文君， 朱冰舟， 董建飞， 唐 瑶，李春如，江 可，孙长胜

(1.浙江泛亚生物医药股份有限公司，浙江 平湖 314200；2.浙江泛亚生命科学研究院，浙江 平湖 314200)

【研究意义】蝉花，民间又称虫花、蝉菌、土虫草、螺花、蝉蜕花、蝉蛹草、蝉茸、知了花、嗓哑花[1]。蝉花是一种传统中药材，最早记载于1600多年的《雷公炮炙论》。隋唐的《药性论》记载：“蝉花味甘寒，无毒。主小儿天吊，惊痫瘈，夜啼心悸”。《本草纲目》记载：“蝉花可治疗惊痫，夜啼心悸”。蝉花有较高的药用价值[2-3]，具有改善肾功能[4-5]、抗肿瘤[6]、免疫调节[7-8]、调节脂类代谢[9]、降血糖[10]、抗氧化[11]、抗衰老[12]、抗疲劳[13]、镇静镇痛[14]、改善机体营养状况[15]等功效。其主要化学成分包括：氨基酸、多糖、生物碱、麦角甾醇、腺苷、虫草酸等[16-17]。蝉花由于具有很高的食用安全性而引起研究人员的注意，有望开发成为新资源食品和新的饲料添加剂[18-19]。【前人研究进展】陈祝安对蝉花的人工培养做了大量研究工作，分离的蝉花菌株在一些自然基物或组合培养基上发酵可长出子实体，从而开创了蝉花人工培养途径[20]。在虫草类真菌人工驯化栽培过程中，菌种的退化现象比较严重，退化菌株在DNA水平上已经产生明显的遗传变异[21]。蝉花人工培养过程中，也遇到菌种退化问题，彭凡通过活体柞蚕蛹和大蜡螟昆虫侵染繁育的方式来恢复蝉花菌种生产性状，但是蚕蛹和大蜡螟非天然寄主，复壮效果并不理想[22]。菌种复壮的活体昆虫往往需要天然寄主才更为有效，蝉花的天然寄主包括竹蝉、蟪蛄、小鸣蝉和山蝉，这些寄主均不能人工养殖。因此，蝉花的繁育复壮需要经野外投放来实现。【本研究切入点】野外繁育的蝉花，除了生产性状的评价，还需要分子方法来进行鉴别。【拟解决的关键问题】本研究通过在毛竹林进行野外繁育复壮获得蝉花菌株，进行子实体培养评价、SCAR和ISSR分子标记分析。本研究结果旨在获得适合工厂化培养的高产、稳定蝉花菌株。

1 材料与方法

1.1 菌株

繁育出发蝉花菌株A17-7-1，由浙江泛亚生命科学研究院提供；蝉花繁育获得菌株由A17-7-1培养物2014年4月投放于浙江安吉的野外繁育毛竹林，2014年7月从野外繁育基地采集分离获得，共获得7个菌株，菌株编号分别为14AJ10、14AJ11、14AJ12、14AJ13、14AJ14、14AJ15、14AJ16。

1.2 菌株子实体培养筛选

按照每个罐头瓶装40 g小麦，水70 mL，用透气膜封口，121 ℃灭菌40 min，自然冷却后接种5 mL蝉花菌株摇瓶种子液,每组重复5瓶，置22～23 ℃培养室光照培养25 d后采收子实体，于60 ℃烘干后称重统计。

1.3 SCAR分子标记

将获得子实体产量明显高于A17-7-1的菌株提取基因组DNA进行ISSR分子标记分析。

SCAR分子标记引物：S11-2-F3 GTAGACCCGTGTTGTATGACAAACT；S11-2-R3 GTAGACCCGTAAGGAGACGGAGGAT，为菌株A17-7-1特异性DNA片段引物，由上海生工生物工程公司合成。其扩增体系见表1。

PCR扩增程序：先95 ℃ 5 min；然后依次95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2分30 s，共循环35次；然后72 ℃ 10 min，最后降温至4 ℃保存。凝胶电泳：PCR产物使用1.2%琼脂糖凝胶电泳，电压100 V，时间40 min。拍照记录。

表1 扩增体系

1.4 ISSR分子标记

将繁育出发菌株及获得的繁育子实体产量增加明显菌株菌丝，加液氮研磨，以CTAB+酚氯仿法提取菌株的总DNA；对待检菌株DNA分别采用下列引物进行PCR扩增，引物由上海生工生物工程公司合成。

所采用的PCR扩增反应体系如下：以P5、P12、P13、M8、M10、M11为引物的反应扩增体系总体积为15 μL。DNA样本：20～50 ng，dNTP：3 nmol，引物：3 pmol，Taq酶：1 U，酶反应缓冲液：1.5 μL，加双蒸水至15 μL。以P18、P19为引物的反应扩增体系总体积为20 μL。DNA样本：20～50 ng，dNTP：4 nmol，引物：4 pmol，Taq酶：1 U，酶反应缓冲液：2 μL，加双蒸水至20 μL(表2)。

以P5、P19和M11为引物的PCR扩增反应条件如下：先94 ℃ 5 min；而后依次94 ℃ 20秒，48 ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，共循环35次；然后72 ℃延伸5 min，最后降温至4 ℃；以P12和M8为引物的PCR扩增反应条件如下：先94 ℃ 5 min；而后依次94 ℃ 20 s，50 ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，共循环35次；然后72 ℃延伸5 min，最后降温至4 ℃；以P13和M10为引物的PCR扩增反应条件如下：先94 ℃ 5 min；而后依次94 ℃ 20 s，54 ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，共循环35次；以P18为引物的PCR扩增反应条件如下：先94 ℃ 5 min；而后依次94 ℃ 20 s，53.5 ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，共循环35次。

表2 ISSR扩增引物

2 结果与分析

2.1 蝉花子实体培养筛选

将获得的7个蝉花菌株及A17-7-1菌株进行子实体培养筛选，结果显示菌株之间子实体产量差异明显，其中菌株14AJ10和14AJ13实体长、密生、粗壮，产量分别为每瓶6.65和6.37 g。14AJ10菌株子实体产量高于繁育出发菌株17-7-1 5.75 g每瓶的产量，差异显著；14AJ13菌株子实体产量略高于繁育出发菌株17-7-1，但差异不显著；14AJ11、14AJ15菌株子实体短、密生、细小；14AJ12子实体短、密生、较粗；14AJ14、14AJ16菌株子实体短、稀疏、细小。14AJ11、14AJ12、14AJ14、14AJ15、14AJ16等5个菌株子实体产量显著远低于A17-7-1菌株。结果见表3和图1。

表3 繁育蝉花菌株的筛选

2.2 SCAR分子标记

由图2显示，通过对繁育获得7个菌株SCAR 标记分析，14AJ10和14AJ13菌株扩增出A17-7-1具有特异条带，分子量约2200 bp，表明14AJ10和14AJ13菌株是由A17-7-1繁育获得。14AJ11、14AJ12、14AJ14、14AJ15、14AJ16等5个菌株未能扩增出条带，表明这5个菌株不含特异性片段，为竹林中本来就存在的菌株。

2.3 ISSR分子标记

依据子实体筛选培养结果和SCAR分析结果，选择子实体产量提高的菌株14AJ0和14AJ13与A17-7-1菌株进行ISSR分析。利用6个ISSR引物对A17-7-1蝉花菌株基因组DNA进行扩增，共计扩增出31个条带，扩增出的条带大小在100～2000 bp之间。P18引物扩增出8个条带，M10引物扩增出7个条带，P13扩增出2个条带，M11扩增出5条条带，P19扩增出5个条带，P5 扩增出4个条带。6个引物对14AJ10菌株DNA进行扩增，结果扩增出的所有条带均与A17-7-1菌株的条带完全一致，表明菌株14AJ10较好的保持了A17-7-1的遗传特性。6个引物对14AJ13菌株DNA进行扩增，M10引物扩增条带相比于A17-7-1，在1500、1200 bp处各有一个条带缺失，其余引物扩增的条带与A17-7-1菌株一致，表明14AJ13菌株部分遗传特性发生了改变(图3)。

3 讨 论

A17-7-1菌株是经过多年选育获得可用于生产的蝉花菌株，但由于传代较多，子实体生产生产性能有一定的下降。通过野外繁育复壮，获得7个菌株。7个菌株经子实体培养比较，有的菌株子实体产量较高，也有的菌株子实体产量非常低。其中14AJ10和13AJ13菌株子实体产量高于A17-7-1菌株，很可能是经野外繁育而来。但由于获得的7个菌株是从野外采集分离纯化而得，很有可能部分菌株是本来就分布于竹林的菌株，需要进行分子鉴别。SCAR 分子标记是重复性好、可靠性高的分子标记技术，不同菌株的 DNA 差异可通过单一条带的出现与否加以判断，是一种非常方便、快捷，可用于快速检测大量个体的方法[23]。因此将7个菌株与A17-7-1进行SCAR 标记分析，可快速有效的判定是否来源于A17-7-1的野外繁育复壮。经SCAR标记分析，14AJ10和14AJ13菌株扩增出A17-7-1特有的条带，表明14AJ10和14AJ13菌株是经野外繁育而来，占获得菌株的28.57%。尽管繁育获得的菌株不多，但菌株经过侵染虫体，子实体生产性能有了一定的恢复，证明了野外繁育蝉花具有有一定的效果。其余菌株未能扩增出A17-7-1特有的条带，应该是竹林原先就存在的菌株蝉花。

ISSR是一种操作简单、高效的检测手段，常用于真菌遗传多态性分析和种内菌株亲缘关系的区分[24]。将子实体生产能力提高，且经SCAR标记确认的14AJ10、14AJ13菌株与菌株A17-7-1进行ISSR分析，发现14AJ10菌株扩增出的条带与A17-7-1产生的条带完全一致，表明14AJ10菌株不仅子实体产量上升，且遗传性状相对稳定。14AJ13菌株子实体产量增加不明显，但经ISSR分析发现，与A17-7-1相比较，14AJ13菌株的M10引物扩增条带有部分缺失，表明14AJ13菌株遗传性状有了明显的变化。通过蝉花野外繁育菌株的筛选和分子鉴别，初步建立了蝉花野外繁育复壮菌株的子实体培养筛选、菌株分子鉴别体系，也获得子实体产量提高的菌株，繁育复壮获得的菌株有望应用于生产中。