麦洼牦牛SMPX基因多态性及其与生长性状的关联分析

2021-12-14钟金城武志娟王吉坤柴志欣

西南农业学报 2021年9期

陈美，钟金城，武志娟，王吉坤，柴志欣

(西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室，四川成都 610041)

【研究意义】牦牛(Bosgrunniens)别名旄牛，素有“高原之舟”之称，是世界上唯一能在高海拔地区低氧、寒冷等极度恶劣气候环境中生存的大型反刍家畜[1-2]。麦洼牦牛是青藏高原型牦牛的地方良种，主要产于四川省阿坝藏族羌族自治州红原县瓦切、麦洼及若尔盖县包座一带，其肉乳兼用[3]，是当地农牧民的主要经济畜种，可提供肉、乳、毛绒、燃料和役力等生活生产必需品[4]。X染色体相关小肌肉蛋白(small muscle protein X-link，SMPX)于1999年首次在人类基因组中发现，定位于染色体Xp22，共编码88个氨基酸，是一种与细胞骨架相关的蛋白，在心肌和骨骼肌以及胎儿内耳中均高度表达[5-8]。【前人研究进展】Ren等[9]对猪SMPX基因进行克隆和鉴定发现，该蛋白编码一个核位置信号肽，两个重叠的酪蛋白激酶II磷酸化位点和一个N-糖基化位点，RT-PCR分析发现该基因主要在骨骼肌和心肌中表达，而在其它组织中的表达水平中等，推测SMPX基因在骨骼肌和心肌的发育过程中发挥作用。Aaron等[7]发现X连锁基因Chisel(Csl/Smpx)所编码的9 kDa蛋白质在心脏和骨骼肌细胞中与肋骨的细胞骨架相关联，并与维持肌肉完整性有关。邓瑞强[10]对猪SMPX基因在胚胎期30、60 d和成年期的背腰最长肌表达水平变化进行检测，发现该基因在化胎期60 d背腰最长肌的表达量约为胚胎期30 d和成年期的14倍。官红平[11]通对猪SMPX基因进行SNPs检测，发现SMPX基因3′ UTR存在A-G突变，且发现该位点的基因型频率在不同品种中存在较大差异。以上研究表明，SMPX基因在骨骼肌肉发育的过程中起调节作用。【本研究切入点】本研究对麦洼牦牛SMPX基因进行多态性检测及关联性分析。【拟解决的关键问题】此结果以期为育种工作中提高牦牛生长性能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于四川省阿坝藏区羌族自治州红原县龙日种畜场选取89头健康成年的麦洼牦牛，其中黑嘴麦洼牦牛(43头)和粉嘴麦洼牦牛(46头)，采集其耳组织样品，75%乙醇保存带回实验室，将样品置于新离心管中-80 ℃保存备用，同时测量牦牛的体重、体高、体斜长、胸围、管围等生长性状数据。

1.2 引物试剂与合成

根据GenBank中黄牛SPMX基因序列(NW_005393903.1)，利用Primer 5对SPMX基因3个外显子及启动子区域设计特异性引物(表1)。引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。

1.3 SPMX基因PCR扩增

根据动物组织基因组DNA提取试剂盒(TianGen生物技术有限公司)提取基因组DNA，置于-20 ℃保存备用。选取10头牦牛个体，每个体取模板DNA 1 μL，构建DNA混合池，配至50 μL。

PCR扩增体系(25 μL)：2×TaqGreen PCRMasterMix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，最后加入7.5 μL ddH2O配至25 μL。扩增条件：预变性(95 ℃ 5 min)，变性(95 ℃ 30 s)，退火温度55 ℃，延伸时间(72 ℃150 s)，35个循环，延伸(72 ℃10 min)。

1.4 数据统计与分析

利用MEGE 5、BLAST在线软件进行测序结果比对，SPSS 19.0 软件计算SMPX基因多态位点在试验群体中的基因杂合度、纯合度、多态信息含量、有效等位基因数和χ2独立性检测，以及该基因不同基因型与生长发育性状的关系，结果用平均数±标准误表示。Independent sample t-test进行差异显著性分析，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增

以牦牛耳组织DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，条带清晰，结果与目的条带一致，SMPX基因外显子扩增长度分别为189、193 和450 bp，启动子长度为2181 bp(图1)。

表1 引物序列

2.2 SNP筛选与分析

将麦洼牦牛SMPX基因测序结果与普通牛该基因序列(NW_005393903.1)比对，在麦洼牦牛SMPX基因外显子区域未检测到SNPs，启动子区域存在2个突变位点，分别为G532A 和C1481G，G532A位点存在GG、GA和AA型3种基因型；C1481G位点3种基因型包括CC、CG和GG型3种基因型(图2)。

2.3 基因型频率及基因频率

对测序结果统计分析发现，纯黑麦洼牦牛和粉嘴麦洼牦牛在G532A位点中均存在GG、GA和AA 3种基因型，其GG型的基因型频率最高，分别达到0.721和0.761，说明2个类群中GG型属于优势基因型，等位基因G为优势等位基因。C1481G位点在2个群体中，CC基因型频率分别为0.605和0.457，等位基因C频率为0.791和0.664，说明在2个群体中CC型均为优势基因型，等位基因C均为优势等位基因(表2)。

表2 SMPX基因的基因型频率和基因频率

2.4 遗传多态性分析

由表3可知，G532A 和C1481G位点在粉嘴和黑嘴2个类群中的多态信息含量(PIC)分别为0.2570、0.2647、0.3084和0.3470(0.250.05，均符合Hardy-Weinberg平衡。

2.5 SMPX基因与牦牛生长性状的关联性分析

利用SPSS 19.0软件对麦洼牦牛SMPX基因突变位点不同基因型与其生长性状进行差异显著性检验，发现在G532A位点中，除纯黑麦洼牦牛GG型个体体高显著高于AA型个体外(P<0.05)，其它各基因型对牦牛生长性状无显著性影响(P>0.05)；而在C1481G位点中，纯黑麦洼牦牛和粉嘴麦洼牦牛的不同基因型间与其生长性状差异均不显著(P>0.05，表4)。

3 讨论

SMPX基因与肌肉的生长发育相关，在人体中SMPX基因可被肌肉调节因子所调控，且该基因总长度为50 kb，包含5个外显子和4个内含子，且在心脏和骨骼肌中大量表达[10-13]。目前，关于SMPX基因的研究主要集中在人[14-16]的听力损失疾病方面，而关于肌肉发育规律方面的研究相对较少。有研究报道，SMPX已有5个突变被证明与人的X连锁显性听力损失有关，其家系均存在表型差异现象[17]；Aaron等[7]发现猪SMPX基因的5′ 和3′ 非编码区存在2个SNPs位点，且该基因在启动子上游区存在MEF2、MyoD和Nkx2.53个结合位点及氨基酸序列中存在2个CK2磷酸化位点[11]。Bai等[18]发现在猪不同表型的肌肉(红肌与白肌)中，BC005948显著差异表达，且在红肌中高表达，推测其与CK2信号通路相关，而CK2主要参与细胞生长、增殖及促进肌细胞的发育，对肌细胞的发育起正控制作用[19]。Kemp等[20]研究发现强运动量的小鼠在引起肌细胞肥大的同时，SMPXmRNA表达量显著升高，推测此基因参与肌细胞肥大的过程，且在筛选NKX-2的靶基因时，发现SMPX基因在IGF-1同时存在的情况下，在C2C12肌细胞中SMPX过表达可增强肌细胞融合[21]。

表3 SMPX基因的群体遗传特性

表4 麦洼牦牛SMPX基因对体尺性状的影响

本试验在纯黑麦洼牦牛和粉嘴麦洼牦牛2个群体的SMPX基因启动子区域共检测到G532A和C1481G 2个SNP位点，在外显子区未发现突变位点。在G532A位点中，这2个群体的优势基因型均为GG型，优势等位基因均为G；而在C1481G位点中，两者的优势基因型均为CC型，优势等位基因均为C，这一结果与Aaron[7]、管红平[11]对猪SMPX基因的SNP位点研究结果存在差异，因不同物种遗传结构及生存环境均存在差异，可能导致其基因序列及突变位点存在一定差异。这2个突变位点的多态信息含量均为中度多态，说明麦洼牦牛遗传变异程度较大，多态性较丰富。G532A和C1481G位点在纯黑和粉嘴麦洼牦牛中的纯合度均大于杂合度，说明这两个位点的纯合基因型积累较多，且遗传变异较小，建议应可适当与其他牦牛品种进行基因交流。

通过对SMPX基因G532A和C1481G位点不同基因型与牦牛生长性状进行关联分析，结果表明，在G532A位点中，仅纯黑麦洼牦牛的GG基因型个体体高显著高于AA基因型个体，该位点可作为影响牦牛体高的分子标记；而在C1481G位点上，不同基因型与其生长性状不相关，可能是麦洼牦牛有进行人工选育造成的结果。目前该基因在多态性方面的研究较少，缺少可供参考的数据，麦洼SMPX基因的G532A位点可作为影响其生长发育性状的分子标记，可用于麦洼牦牛分子育种。