耐旱与旱情敏感甘蔗品种根际土壤细菌群落组成及功能比较

陈思宇，孙 妍，覃仁柳，杨尚东*，谭宏伟

(1.广西大学农学院，广西 南宁 530004；2.广西农业科学院/广西甘蔗遗传改良重点实验室，广西 南宁 530007)

【研究意义】甘蔗(SaccharumofficinarumL.)是世界上最主要的糖料作物[1]和极具开发潜力的能源作物，已在我国广西、广东、云南和福建等南方地区广泛栽培[2]。甘蔗植株高大，生长周期长，对水分需求量大，但我国甘蔗栽培区频繁的干旱灾害，已成为制约甘蔗生产发展的重要因子[3-4]。选育耐旱甘蔗品种是甘蔗育种研究的一项重要内容[5]，耐旱甘蔗育种研究中多依赖品种的田间表现及在胁迫条件下以植株生理生化指标的变化判断其耐旱能力，缺乏评价甘蔗植株耐旱能力的稳定生物学指标。长期以来，植株的田间表现及超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等保护性酶活性和丙二醛含量等生物学指标常被用于指示植物的抗逆性强弱[6]，但以田间表现和生理生化指标进行耐旱性判定不仅耗时较长，而且由于具有较大的随机性和偶然性，费时而不敏感。已有研究表明，根际土壤细菌群落组成及其功能在生态系统修复[7-8]，植物连作土壤[9]及盐碱地土壤[10]的开发利用中都具有一定指示作用，但至今缺乏针对田间条件下不同适应性甘蔗品种根际土壤微生物群落结构的比较研究。因此，分析耐旱性不同甘蔗品种根际土壤细菌群落结构及功能，对筛选和开发利用有益功能细菌及构建新型甘蔗耐旱评价体系和保障我国甘蔗产业可持续发展具有积极意义。【前人研究进展】现有研究表明，根际土壤细菌对不同耐旱性的骆驼蓬[11]和小麦[12]具有一定影响，根际土壤微生物对甘蔗影响的研究则多集中在不同栽培模式及抗病影响等方面[13-14]。已有研究表明，不同基因型或不同抗性作物品种的根际微环境会富集不同的微生物群落[15]，土壤微生物对土壤理化性状变化非常敏感[16]，且已广泛作为指示土壤肥力状况及质量评价的生物学指标[17]。然而，至今育种研究中针对耐旱基因型的筛选多集中在植株自身的生物学性状方面，例如：干旱会显著降低甘蔗的根长、根干重和根表面积等根系性状，但对根冠比无显著影响[18]，这些根系指标对评价甘蔗的耐旱性具有参考意义。但是针对土壤生物学性状[19]尤其根际土壤微生物与植株抗性相关性状方面的研究还鲜见报道[20-23]。Xie等[24]、刘方[25]、潘根生等[26]、李跃等[27]研究结果显示，植物具有通过改变其乙烯、脱落酸和乙酰水杨酸等内源激素含量水平提高其耐旱性的能力。其中，脱落酸对植株的耐旱能力发挥着关键作用，不仅可改变植物干旱胁迫下细胞的转录水平，还可影响植物脂类代谢和碳代谢等基础代谢过程，具有启动植物耐旱响应的功能[28]。脱落酸在干旱条件下对维持根系生长、渗透物质积累及活性氧代谢都有较强作用。此外诸多研究表明，细菌与生长素[29]、细胞分裂素[30]、脱落酸[31]、赤霉素[32]及乙烯[33]等植物内源激素的产生紧密相关。【本研究切入点】目前，通过不同耐旱性甘蔗品种根际土壤微生物群落结构组成比较以筛选和开发利用有益功能细菌的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】比较田间自然条件下2个不同耐旱性甘蔗品种根际土壤细菌群落组成及其代谢功能，揭示不同耐旱性甘蔗品种的田间适应性差异机制，挖掘有助于提高甘蔗耐旱能力的功能细菌优势门属，为筛选和开发利用有益功能细菌及构建评估甘蔗耐旱能力的新型技术体系提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2019年3—10月在广西大学农学院试验基地(东经108°17′，北纬22°51′)设施大棚内进行。采用桶栽方式种植甘蔗。桶的规格为上径49.3 cm、下径34.5 cm、高度35.0 cm。每桶装土约40 kg，种植3个单芽甘蔗茎段，桶底部钻5个直径为4.0 cm的圆孔。桶装土壤按大田表土∶市售有机肥=5∶1混匀，土壤理化性质：pH 5.5，有机质21.6 g/kg，全氮1.15 g/kg，全磷0.72 g/kg，全钾8.30 g/kg、碱解氮98.00 mg/kg，速效磷10.80 mg/kg，速效钾156.00 mg/kg。

1.2 试验材料

选取桂辐98-296(代号G1)和桂糖36号(代号G2)分别作为不同耐旱性甘蔗品种种植于桶装土壤中，以不种植甘蔗的桶装土壤为空白对照(CK)，共3个处理，每处理15桶。其中，桂辐98-296是具有良好耐旱、耐寒和耐涝等抗逆境能力且耐旱能力优于新台糖22号的甘蔗品种(系)[34]，而桂糖36号适应中等水肥条件，耐旱能力逊色于新台糖22号，属于对水分敏感、旱情敏感的甘蔗品种(系)[35]。上述甘蔗品种均在相同水肥条件下以常规方式进行栽培管理。

1.3 试验方法

1.3.1 土壤样品采集 甘蔗进入伸长期后，分别随机采集3个处理的根际土壤样品。其中，2个甘蔗品种随机选取长势基本一致的3桶甘蔗植株，砍去上部蔗茎，留高30.0 cm蔗兜后，翻转栽植桶倒出整个蔗兜，采用抖根法[36]收集根际土壤样品；采用随机取样法采集CK的土壤样品。

1.3.2 Alpha多样性分析和物种Venn图分析 使用UPARSE软件对序列OTU进行97%相似度聚类分析并除去单序列和嵌合体，生成OTU表格；计算Alpha多样性指数，以Shannon和Simpson指数指示细菌的多样性，以Chao 1和Ace指数指示细菌的丰富度，并构建物种群落柱形图和土壤物种组成Venn图。以上数据均利用上海美吉生物医药科技有限公司提供的数据分析平台I-Sanger进行分析。

1.3.3 根系样品总DNA提取、PCR扩增和序列测定 测序具体类型与引物序列见表1。DNA抽提：土壤微生物总DNA采用FastDNA®Spin Kit for Soil试剂盒(MP Biomedicals，美国)抽提，以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的质量，并利用NanoDrop2000分光光度计(Thermo fisher scientific，美国)检测DNA浓度和纯度；在ABI GeneAmp®9700上，以提取的植物微生物DNA为模板，选择338F和806R引物对V3～V4可变区进行PCR扩增。将同一样本的PCR产物混合后使用2.0%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen biosciences，Union City，CA，美国)进行回收产物纯化，2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，并用QuantusTMFluorometer(Promega，美国)对回收产物进行检测定量。Illumina MiSeq测序：对PCR产物进行定量均一化混匀，使用NEXTFLEX®Rapid DNA-Seq Kit进行建库：利用聚合DNA产物构建MiSeq文库，利用MiSeq PE250平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。

1.3.4 PICRUSt基因功能预测 首先通过PICRUSt去除16S Marker gene在物种基因组中拷贝数的影响，标准化OTU丰度表；利用每个OTU对应的green gene id，获得OTU对应的KEGG Orthology(KO)信息和COG家族信息；并计算各COG丰度和KO丰度。通过COG数据库对eggNOG数据库进行解析，得到各COG的描述信息，以及其功能信息，并得到功能丰度谱；利用KEGG数据库的信息，得出KO、Pathway和EC的数据，通过OTU丰度计算各功能类别的丰度。

1.4 统计分析

试验数据采用Excel 2019和SPSS 21.0进行统计分析，并利用上海美吉生物医药科技有限公司的I-sanger云数据分析平台进行在线数据分析。

2 结果与分析

2.1 不同耐旱性甘蔗品种根际土壤细菌物种分类统计结果

由表2可知，桂辐98-296的根际土壤细菌隶属于28门65纲151目282科495属897种2121 OTUs；桂糖36号的根际土壤细菌隶属于27门64纲149目279科493属892种2109 OTUs；CK的根际土壤细菌隶属于27门64纲147目279科491属878种2100 OTUs。可见，桂辐98-296的根际土壤细菌数量在门、纲、目、科、属和种分类水平上均高于相应的桂糖36号和CK，而桂糖36号根际土壤中，细菌分类数量仅在目、属和种分类水平上高于CK。表明不同分类水平下，耐旱甘蔗品种桂辐98-296根际土壤中拥有比旱情敏感甘蔗品种桂糖36号根际土壤更丰富的根际土壤细菌种类与数量。

2.2 不同耐旱性甘蔗品种根际土壤细菌的Alpha多样性

由表3可知，2个不同耐旱性甘蔗品种和CK间根际土壤细菌的Shannon、Simpson、ACE和Chao 1指数均无显著差异(P>0.05)。由此推测，在自然条件下，2个不同耐旱性甘蔗品种的根际土壤细菌可能未产生应激反应，从而使其细菌的多样性和丰富度未表现出显著差异特征。

表1 测序类型及引物序列名称

表2 不同耐旱性甘蔗品种根际土壤细菌物种分类结果

表3 不同耐旱性甘蔗品种根际土壤细菌的Alpha多样性比较

2.3 不同耐旱性甘蔗品种根际土壤细菌群落结构分析

2.3.1 优势细菌群落在门分类水平的分析结果 从图1可看出，在门分类水平，CK土壤的优势细菌门分类组成丰度占比排序为变形菌门(Proteobacteria，28.22%)>放线菌门(Actinobacteria，21.80%)>酸杆菌门(Acidobacteria，16.37%)>绿弯菌门(Chloroflexi，14.67%)>厚壁菌门(Firmicutes，5.14%)>芽单胞菌门(Gemmatimonadetes，3.51%)>硝化螺旋菌门(Nitrospirae，2.89%)>拟杆菌门(Bacteroidetes，1.20%)>疣微菌门(Verrucomicrobia，1.44%)>浮霉菌门(Planctomycctcs，1.14%)和其他(others)门类(3.63%)；桂辐98-296根际土壤的优势细菌门分类组成丰度占比排序为变形菌门(32.06%)>放线菌门(26.24%)>绿弯菌门(12.31%)>酸杆菌门(11.15%)>厚壁菌门(Firmicutes，5.89%)>芽单胞菌门(3.18%)>硝化螺旋菌门(2.81%)>拟杆菌门(1.68%)和其他门类(2.93%)；桂糖36号根际土壤的优势细菌门分类组成丰度占比排序为变形菌门(32.41%)>放线菌门(25.61%)>绿弯菌门(11.97%)>酸杆菌门(11.63%)>厚壁菌门(6.20%)>芽单胞菌门(2.95%)>硝化螺旋菌门(2.23%)>拟杆菌门(1.68%)>疣微菌门(1.05%)和其他门类(3.43%)。可见，与CK相比，2个不同耐旱性甘蔗品种的根际土壤微生物群落丰度组成均发生了变化，其中，2个甘蔗品种根际土壤变形菌门、放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门细菌的丰度占比上升，酸杆菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门和硝化螺旋菌门细菌的丰度占比下降。同时，桂辐98-296根际土壤疣微菌门和浮霉菌门细菌的丰度占比小于1.00%，丧失优势细菌群落地位，而桂糖36号根际土壤中浮霉菌门细菌的丰度占比亦小于1.00%，同样丧失了优势细菌群落地位。

2.3.2 优势细菌群落在属分类水平的分析结果 从图2可看出，在属分类水平，桂辐98-296、桂糖36号和CK土壤中细菌丰度占比大于1.00%的优势细菌属分别有18、17和17个。其中，CK土壤中的优势细菌属丰度占比排序为norank_c_Acidobacteria(10.59%)>芽孢杆菌属(Bacillus，3.00%)>硝化螺旋菌 (Nitrospira，2.89%)>norank_c_KD4-96(2.55%)>norank_o_Gaiellales(2.43%)>H16(2.41%)>norank_f_Gemmatimonadaceae(2.40%)>玫瑰弯菌属(Roseiflexus，2.35%)>norank_c_Actinobacteria(2.18%)>norank_f_Anaerplineaceae(2.15%)>norank_f_Xanthobacteraceae(2.02%)>norank_f_Nitrosomonadaceae(1.94%)>norank_f_Acidimicrobiales(1.71%)>norank_f_Rhodobiaceae(1.51%)>norank_c_TK10(1.43%)>11-24(1.42%)>norank_f_Rhodospirillaceae(1.38%)和其它(others)属(43.25%)；桂辐98-296根际土壤的优势细菌属丰度占比排顺序为norank_c_Acidobacteria(7.11%)>芽孢杆菌属(3.53%)>硝化螺旋菌属(2.81%)>H16(2.18%)>norank_f_Gemmatimonadaceae(2.16%)>norank_o_Gaiellales(1.99%)>金霉素链霉菌(Streptomyces，1.95%)>norank_c_KD4-96(1.94%)>norank_f_Rhodospirillaceae(1.86%)>norank_f_Acidimicrobiales(1.71%)>玫瑰弯菌属(1.65%)>norank_f_Anaerplineaceae(1.64%)>norank_o_JG30-KF-CM45(1.61%)>norank_f_Xanthobacteraceae(1.59%)>norank_c_Actinobacteria(1.39%)=norank_f_Nitrosomonadaceae(1.39%)=norank_f_Actinobacteria(1.39%)>马杜拉菌属(Actinomadura，1.35%)和其它属(48.87%)；桂糖36号根际土壤的优势细菌属丰度占比排序为norank_c_Acidobacteria(7.34%)>芽孢杆菌属(3.69%)>硝化螺旋菌属(2.23%)>norank_f_Rhodospirillaceae(2.20%)>norank_o_Gaiellales(2.01%)>norank_f_Gemmatimonadaceae(1.94%)=norank_c_KD4-96(1.94%)>unclassified_o_Frankiales(1.91%)>H16(1.85%)=玫瑰弯菌属(1.85%)>马杜拉菌属(1.82%)>金霉素链霉菌属(1.68%)>norank_f_Xanthobacteraceae(1.61%)=norank_f_Acidimicrobiales(1.61%)>norank_c_Actinobacteria(1.50%)>norank_f_Anaerplineaceae(1.44%)>norank_o_JG30-KF-CM45(1.40%)和其它属(48.71%)。可见，与CK土壤相比，马杜拉菌属、norank_c_Actinobacteria、unclassified_o_Frankiales和norank_o_JG30-KF-CM45是2个不同耐旱性甘蔗品种根际土壤富集的优势细菌属，但同时，2个甘蔗品种根际土壤亦缺失了CK土壤中的11-24、norank_c_TK10和norank_f_Rhodobiaceae等优势细菌属；与旱情敏感甘蔗品种桂糖36号相比，norank_f_Nitrosomonadaceae和norank_c_Actinobacteria是耐旱甘蔗品种桂辐98-296根际土壤特有的优势细菌属，但耐旱甘蔗品种桂辐98-296根际土壤亦缺失了优势细菌属unclassified_o_Frankiales。

2.4 物种Venn图分析结果

从细菌Venn图(图3-A)可看出，桂辐98-296、桂糖36号根际土壤和CK土壤在属分类水平分别有495、493和491属。其中，三者共有细菌属472个，桂辐98-296根际土壤特有细菌属仅1个，桂糖36号根际土壤无特有细菌属，而CK土壤特有的细菌属最多，为6个。从图3-B可看出，桂辐98-296、桂糖36号根际土壤和CK土壤细菌在种分类水平分别有897、892和878种。其中，三者共有细菌种845个，桂辐98-296根际土壤特有细菌种3个，桂糖36号根际土壤特有细菌种仅1个，而CK土壤特有细菌种有6个。可见，根际土壤细菌在属和种水平的数量均为桂辐98-296多于桂糖36号，且桂辐98-296拥有的特有根际土壤细菌数量多于桂糖36号。说明耐旱甘蔗品种桂辐98-296根际土壤中拥有比旱情敏感甘蔗品种桂糖36号更丰富的特有细菌种属可能是其更耐旱的重要原因之一。

2.5 PICRUSt功能预测

基于高通量测序技术分析结果，与KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库比对，发现2个不同耐旱性甘蔗品种根际土壤细菌基因一级功能层共包含6类生物代谢通路(图4)，即代谢(Metabolism)、环境信息处理(Environmental information processing)、细胞过程(Cellular processes)、遗传信息处理(Genetic information processing)、人类疾病(Human diseases)和有机系统(Organismal systerms)；与CK相比，2个不同耐旱性甘蔗品种根际土壤细菌一级功能层的6类代谢通路占比均较高，而桂糖36号根际土壤细菌一级功能层的6类代谢通路占比高于桂辐98-296根际土壤细菌。

由图5可知，2个不同耐旱性甘蔗品种根际土壤细菌基因二级功能层主要由发育(Development)、细胞群落—真核生物(Cellular community-eukaryotes)、信号分子与相互作用(Signaling molecules and interaction)、细胞活性(Cell motility)和核苷酸代谢(Nucleotide metabolism)等46个子功能组成。其中，桂糖36号根际土壤细菌的碳水化合物代谢(Carbohydrate metabolism)、内分泌系统(Endocrine system)、运输和分解(Transport and catabolism)、膜运输(Membrane transport)、核苷酸代谢、感觉系统(Sensory system)及环境适应(Environmental adaptation)等42个二级功能层预测基因拷贝数虽然高于桂辐98-296根际土壤，但细胞活性、细胞群落真核生物、信号分子与相互作用、排泄系统(Excretory system)和发育等功能基因拷贝数则以桂辐98-296根际土壤高于桂糖36号根际土壤相应的功能基因拷贝数，尤其是信号分子与相互作用和发育功能基因拷贝数分别较桂糖36号根际土壤提高10.78%和12.55%。

3 讨 论

已有研究发现，脱落酸、细胞分裂素[37]与作物植株耐旱性紧密相关；同时，脱落酸含量与绿弯菌门细菌的丰度占比呈显著正相关[38]；放线菌门细菌不仅与脱落酸、茉莉酸和水杨酸等抗逆防御类植物激素的总含量呈显著正相关[38]，而且在干旱胁迫下其相对丰度增加[39]；芽单胞菌门与土壤的干旱程度成正相关[40]。本研究发现，耐旱甘蔗品种桂辐98-296根际土壤中绿弯菌门、放线菌门和芽单胞菌门细菌的丰度占比均高于旱情敏感甘蔗品种桂糖36号根际土壤相应门类细菌的丰度占比，但变形菌门细菌的丰度占比低于旱情敏感甘蔗品种桂糖36号根际土壤的变形菌门细菌。说明桂辐98-296根际土壤富集了绿弯菌门、放线菌门和芽单胞菌门等具有提高植物抗逆能力的细菌门类，这些功能细菌的富集对提升桂辐98-296的耐旱性具有重要作用。

本研究中，芽孢杆菌属、norank_c_Acidobacteria、norank_f_Actinobacteria、norank_f_Acidimicrobiales、norank_f_Anaerplineaceae、norank_f_Xanthobacteraceae、norank_f_Rhodospirillacea、norank_c_KD4-96、norank_o_Gaiellales、norank_f_Gemmatimonadaceae、norank_o_JG30-KF-CM45、马杜拉菌属、金霉素链霉菌属、玫瑰弯菌属、H16和硝化螺旋菌属等细菌属是2个不同耐旱性甘蔗品种根际土壤细菌的共有优势菌属。其中，金霉素链霉菌属细菌在耐旱甘蔗品种桂辐98-296根际土壤中的丰度占比高于旱情敏感甘蔗品种桂糖36号；同时，norank_f_Nitrosomonadaceae和norank_c_Actinobacteria属细菌是耐旱甘蔗品种桂辐98-296根际土壤特有的优势细菌属；耐旱甘蔗品种桂辐98-296根际土壤除拥有诸如芽孢杆菌属等与旱情敏感甘蔗品种桂糖36号一致的有益功能菌属外，还富集了诸如未分类的放线菌属、金霉素链霉菌属等优势细菌属。已有研究证实，放线菌属细菌具有提高植物利用水和矿物质[41]、促进植物细胞分裂素和水杨酸合成[42]及通过提高脱落酸和细胞分裂素含量增强植物耐旱能力的作用。本研究中耐旱甘蔗品种桂辐98-296根际土壤富集了放线菌属等特有的有益功能优势菌属，但旱情敏感甘蔗品种桂糖36根际土壤中缺失了放线菌属等优势细菌属，可能是二者耐旱性存在差异的重要原因之一。

本研究中，2个不同耐旱性甘蔗品种根际土壤细菌的基因一级功能层代谢通路虽然相仿，但耐旱甘蔗品种桂辐98-296根际土壤细菌的生物功能通路占比及部分细菌基因功能低于旱情敏感甘蔗品种桂糖36号根际土壤细菌，信号分子与相互作用及发育功能基因拷贝数均高于旱情敏感甘蔗品种桂糖36号根际土壤细菌。由此推测，信号分子与相互作用及发育功能更强大的耐旱甘蔗品种一旦遭遇胁迫条件，其根际土壤中细菌的响应速度或能力可能强于旱情敏感甘蔗品种根际土壤细菌，这可能也是桂辐98-296的耐旱性更强的重要原因之一。

本研究在设施中采用盆栽方式探究耐旱和旱情敏感甘蔗品种根际土壤细菌群落组成的差异，若在大田进行，由于难以控制环境条件，不仅不利于比较耐旱程度不同品种根际土壤细菌的组成，而且难以筛查耐旱品种根际土壤中的有益功能菌属。但试验在设施中进行，试验结果并不影响未来将筛选出的有益功能菌属应用于实际的大面积生产。

4 结 论

与旱情敏感甘蔗品种桂糖36号相比，耐旱甘蔗品种桂辐98-296根际土壤中富集了丰度高占比且具有提高植物抗逆功能的绿弯菌门、放线菌门和芽单胞菌门等优势细菌门类；同时还富集了未分类的放线菌属和金霉素链霉菌属等特有优势细菌属，并拥有更丰富的信号分子与相互作用功能。桂辐98-296根际土壤中富集的norank_f_Nitrosomonadaceae和norank_c_Actinobacteria等特有优势细菌属有望作为提高甘蔗耐旱能力的备选功能菌属。