广西石漠化地区核桃主要病害调查及病原菌鉴定

林珊宇，朱桂宁*，贤小勇，韦小妹，黎柳锋，李慈代，韦名壮， 韦爱娜，韦 艺，黄明金，韦桥现，廖仁昭

(1.广西农业科学院植物保护研究所/广西作物病虫害生物学重点实验室，广西 南宁 530007；2.凤山县核桃科研开发中心，广西 凤山 547600；3.天峨县林业局，广西 天峨 547300；4.东兰县林业局，广西 东兰 547400；5.河池市核桃研究所，广西 河池 547000；6.南丹县核桃产业发展中心，广西 南丹 547200)

【研究意义】核桃又称胡桃，隶属于胡桃科(Juglandaceae)，包括核桃属(Juglans)和山核桃属(Carya)等，为落叶乔木或稀灌木，与腰果、榛子和扁桃并称为世界四大干果，已在世界各地广泛种植。核桃具有抗旱和耐瘠特点，可适应多种土壤，在石缝等恶劣环境中也可良好生长，是一种重要的“木本粮油”生态树种[1-5]。桂西北河池市的石漠化地区地处滇桂黔石漠化连片贫困区的核心区域，存在水土流失严重、土地生产力低下、群众生活贫困及生态环境恶劣等问题，寻求科学合理的生态修复与经济发展最佳结合模式，对解决石漠化问题、推动当地经济发展及改善贫困农户的生活水平十分重要[2，6]。经过十多年的培育和实践，广西的核桃产业不仅有效解决了大石地区石漠化综合治理难题，还成为促进群众脱贫增收的重要途径，经济、社会和生态综合效益良好[1-2]。2017年，广西核桃种植面积约21.33万hm2，主要分布在河池市、百色市、贺州市和柳州市的21个县(区)。其中，河池市巴马县和凤山县的核桃种植面积最大，达16.00万hm2，占广西核桃种植总面积的70%以上；河池市2017年已可采收的核桃面积有4666.67 hm2，产值达1亿元。因此，核桃已逐步成为河池市石漠化地区生态修复和实施精准扶贫的重要产业之一[5，7]。随着广西核桃种植面积的不断扩大，其产业发展也面临病虫危害日趋严重的严峻问题。因此，开展广西石漠化地区核桃病害发生情况调查，明确核桃病害的种类并鉴定其病原菌，对指导精准有效地防控核桃病害及促进广西核桃产业可持续发展具有重要意义。【前人研究进展】据报道，侵染核桃的病害有20多种。曲文文等[8]调查发现，山东核桃的主要病害为炭疽病(Colletotrichumgloeosporioides)、褐色顶端坏死病(Alternariasp.，Pantoeaagglomerans)和溃疡病(Fusariumsolani，Botryosphaeriaribis)等。赵玉美等[9]开展云南核桃病害调查，发现核桃枝干上的真菌有24属28种，包含干腐病(B.dothidea、Macrophomamacrospora)、枝枯病(Melanconisjuglandis、Phomajuglandis等)和枯梢病(Phomopsisjuglandina、P.arnoldia、Selenophomasp.)等。张知晓等[10]研究表明，云南核桃果实的主要病害有炭疽病、果腐病[B.dothidea(无性态为Dothiorellagregaria)，Pestalosphaeriajuglandis(无性态为Pestalotiopsisdisseminata)]、枯果病(Fusicoccumsp.)和黑斑病(Xanthomonascampestrispv.Juglandis，P.agglomerans)，病原菌分属于17属17种。杨文渊等[11]研究显示，西藏核桃的主要病害有枝枯病[Melanconiumjuglandis(无性态为M.juglandinum)]、细菌性黑斑病(X.campestrispv.Juglandis)、褐斑病[Gnomonialeptostyla(无性态为Marssoninajuglandis)]和腐烂病(Cytcosporajuglandicola)。任志勇等[12]研究报道，甘肃省陇南核桃的病害有细菌性黑斑病、褐斑病、炭疽病、灰斑病(Phyllostictajuglandis)、白粉病(Microsphaeraakebiae)、粉霉病(Microstromajuglandis)、膏药病(Septobasidiumbogoriense)、溃疡病、枝枯病、干腐病(Physalosporajuglandis)和腐烂病，病原有1种细菌和10种真菌。杨霞等[13]研究发现，贵州正安县核桃的主要病害有黑斑病、炭疽病、膏药病、溃疡病和枝枯病。Zhu等[14]研究认为，引起广西核桃叶斑病的是C.fioriniae。汪筱雪等[15]研究表明，广西核桃病害有根腐病(F.solani)、胡桃楸拟茎点霉(P.juglandina)引起的枝枯病、茎点霉黑斑病(Phomasp.)和炭疽病。韦林[16]研究显示，石漠化地区核桃病害以黑斑病、腐烂病和枯枝病等为主。梁钟方[17]研究报道，石漠化地区核桃病害有白粉病、褐斑病、黑斑病和炭疽病。真菌的rDNA-ITS序列为中度保守区，其进化速率较快，已广泛应用于真菌的分类鉴定[8，15，18]，通过测定分析病原菌的rDNA-ITS序列可区分传统上真菌的有些特征受不同培养条件影响而存在的差异，以及产孢结构与孢子形态间的细微特征。【本研究切入点】广西核桃种植区横跨南亚热带和中亚热带，常年光照充足，气候温暖，雨量充沛，各种农林作物病虫害发生频繁，为害严重[7，19-20]。但目前鲜见针对广西核桃病害进行调查和病原鉴定的系统性研究报道。【拟解决的关键问题】在广西河池市的凤山县、东兰县、巴马县、天峨县、南丹县、环江县和金城江区等石漠化地区调查核桃病害的发生情况，分离其病原菌，并通过形态学特性观察、结合部分病菌的rDNA-ITS序列测定分析，以及接种确定其致病性，鉴定主要病害的病原菌，以明确广西石漠化地区核桃的主要病害种类，为其综合防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病害标本采集 2018—2019年，分别在广西河池市凤山县、东兰县、巴马县、天峨县、南丹县、环江县和金城江区等石漠化地区的核桃主要种植区，采集当地主要种植的核桃品种娘青、三台核桃、凤优1号、云南漾濞大泡、云新进而香玲及美国山核桃的病叶、病枝条、病果、病树干和病根标本，分别装入自封塑料袋中带回实验室，记录病害发生情况、病害症状及特征，备用。

1.1.2 培养基选择 参考张知晓等[10]的方法，以PDA培养基为分离病原菌的培养基，配方为马铃薯(去皮)200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，加入去离子水，定容至1000 mL后分装，进行常规灭菌备用；分离真菌时，将PDA培养基溶化后冷却至约50 ℃，加入氨苄青霉素使其最终浓度为50 μg/mL。

1.2 试验方法

1.2.1 病害标本切片制作及观察鉴定 对采集的新鲜病害标本，如已有明显病征，则先进行拍照和文字描述，然后取病征明显的部位制作标本切片，于奥林巴斯BX53光学显微镜下观察病原菌(子实体、菌丝、产孢梗和分生孢子等)的形态特征，记录其在核桃组织上的位置、形状和颜色，必要时测量孢子的大小，查阅相关文献，进行种类鉴定；如病害标本病征尚不明显，则将标本放入干净培养皿中，置于室温(25～28 ℃)下进行保湿培养，待标本出现明显病征后再进行切片制作和病原菌观察鉴定。

1.2.2 病原菌分离培养和纯化 采用组织分离法对病害标本进行病原菌分离。剪取新鲜病害标本病健交界处约5 mm×5 mm的组织块，用75%酒精浸泡40～50 s进行表面消毒后取出，立即用ddH2O冲洗3次，置于灭菌吸水纸中吸去多余水分，晾干后将组织块转入PDA培养基中，置于28 ℃培养箱中培养，待组织上长出菌落后，切取菌落边缘约5 mm×5 mm的菌丝块转入新的PDA培养基中进行病菌纯化。如有分生孢子产生，则采用单孢分离法纯化菌株。所得菌株均转接到PDB培养基中，加入适量甘油后置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 病原菌致病性测定 于室内对果实(青果)进行离体接种；于网室对叶片、枝条和根进行活体接种。操作步骤：先用75%酒精对健康核桃叶片、果实或枝条进行表面消毒，再用ddH2O冲洗3次，自然晾干；用灭菌接种针在核桃叶片、果实、枝条或根上待接种部位刺6个针孔，每个针孔距离约2 mm，待测病原菌预先在PDA培养基上28 ℃培养5～7 d，接种时用灭菌打孔器从菌落边缘打取直径为5 mm的菌丝块，菌丝面朝下接种至核桃叶片、果实、枝条或根的伤口上，每种菌株接种重复3次，每次接种叶片、果实、枝条或根3张/个/条，同时设无伤口处理为对照。果实离体接种后放入保鲜盒中，盖上盖子置于室温下保湿；叶片、枝条或根接种后，将灭菌脱脂棉用ddH2O蘸湿敷在接种好的菌丝块上，然后套上保鲜袋保湿2 d，定期观察发病情况，出现病征后，取发病组织再次分离病原菌，观察再分离获得菌株的形态特征是否与原来接种菌株相同。

1.2.4 病原菌形态学鉴定 将经纯化的病原菌接种在PDA培养基上，置于28 ℃生化培养箱中培养，定期观察病原菌菌落的生长状况(生长速度、形状、大小和颜色等)，并在奥林巴斯BX53光学显微镜下观察、描述病原菌菌丝和孢子等的特征，查阅相关文献，进行病原菌种类鉴定。

1.2.5 病原菌rDNA-ITS序列测定 从PDA培养基上刮取生长约7 d的待测病原菌菌丝，参考Zhu等[21]的方法进行病原菌基因组DNA提取。利用通用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)进行病原菌的rDNA-ITS序列PCR扩增。PCR反应体系50 μL：DNA模板2 μL，2×EsTaqMasterMix 25 μL，引物ITS4(10 μmol/L)和 ITS5(10 μmol/L)各2 μL，ddH2O 19 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行35个循环；72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，将合格的PCR扩增产物送至广州擎科生物技术有限公司进行单向测序。测序获得的结果在http://www.ncbi.nlm.nih.gov网站上进行BLAST比对。根据ITS序列比对结果，结合形态特征进行病原菌鉴定，明确其分类地位。

2 结果与分析

2.1 广西石漠化地区核桃病害种类调查结果

调查结果(表1)表明，广西河池市凤山县、东兰县、巴马县、天峨县、南丹县、环江县和金城江区等石漠化地区核桃的病害有：炭疽病(Anthracnose)、黑斑病(Blact spot)、枯枝病(Branch dieback)、溃疡病(Canker)、根腐病(Root rot)和白粉病(Powdery mildew)。其中，核桃炭疽病发病普遍，危害严重，发病严重的果园大面积落果，叶片提早脱落，个别果园核桃绝收；黑斑病和枯枝病发生程度中等，在各县(区)主要核桃种植区均有发生，但危害程度较炭疽病轻；溃疡病虽然在各县(区)都有发生，但仅在套种有玉米和桑树的果园发生较多，其他果园仅零星发生；根腐病仅在天峨县、金城江区、环江县和凤山县的个别核桃种植区发生，且发病均较轻；白粉病仅在凤山县核桃果园发生。说明核桃炭疽病是广西石漠化地区核桃的最主要病害，其次是黑斑病和枯枝病。

表1 广西石漠化地区核桃病害调查结果

2.2 广西石漠化地区核桃病害的症状和病原鉴定结果

2.2.1 核桃炭疽病 发病症状：核桃炭疽病可为害核桃的叶片、芽、嫩梢和果实。病菌侵入叶片后，初期形成圆形小斑，随后病斑扩大，呈圆形或不规则形，在叶脉处则常呈长条形，有时可从叶片边缘向内部发展呈焦枯状；病斑褐色至黑色，有时在病斑边缘有黄色晕圈，后期病斑可在中间呈灰白色并可形成穿孔，发病严重时可造成叶片大量脱落；果实上的病斑初期为褐色小斑，后扩大逐渐变成黑色，病斑圆形或近圆形，中央凹陷，发病严重的果实全果发黑腐烂，造成果实早落；芽和嫩梢染病，病斑黑褐色至黑色，呈不规则形或长条形，中央凹陷，芽和嫩梢逐渐从顶端向下回枯；叶片、果实和嫩梢上的病斑均可扩展连接成片，后期病斑上可产生小黑点，湿度大时小黑点上可溢出橘红色分生孢子团(图1-A、图1-B和图1-C)。

病原菌分离及致病性测定：从各核桃主要种植区采集的炭疽病标本上分离获得HT02、HT05、SHT1和SHT2共4株菌株，将其分别接种核桃叶片、果实、芽和嫩梢，均可引起炭疽病症状，再分离获的菌株的形态特征与接种菌株一致。

病原菌的形态特征：将采回的核桃炭疽病标本在室温下保湿3～5 d，病斑上即产生并溢出橘红色分生孢子团。挑取分生孢子团在显微镜下观察，可见分生孢子为单胞，无色，圆柱形或长椭圆形，大部分孢子两端钝圆，少数孢子的一端略尖，大小为(11.72±2.10)μm×(5.51±0.19)μm(图1-F)。分离到的HT02、HT05、SHT1和SHT2菌株在28 ℃下PDA培养基上的菌落为圆形，菌丝放射状，菌落初为白色，后从中央开始逐渐变成灰白色、浅灰色、灰绿色或墨绿色，菌丝密集，4个菌株的颜色变化略有不同。培养后期，在菌落上出现橘红色分生孢子堆，呈点状散布于菌丝上，分生孢子的形状、大小与标本上的一致。未发现子囊孢子。

A～C：叶片症状；D～E：果实症状；F：病菌的分生孢子 A-C：Symptoms on leaves；D-E：Symptoms on fruits；F：Conidia图1 核桃炭疽病的症状和病原菌形态特征Fig.1 Symptoms and pathogens morphological characteristics of walnut anthracnose

A～B：自然发病症状；C：HT12菌株回接叶梗上的症状；D：病菌的分生孢子 A-B：Symptoms in field；C：Symptom on stalk inoculated by HT12；D：Conidia图2 核桃黑斑病的症状和病原菌形态特征Fig.2 Symptoms and pathogens morphological characteristics of walnut black spot

rDNA-ITS序列测定结果：对HT02、HT05、SHT1和SHT2菌株rDNA-ITS序列的PCR产物进行测序，获得的序列与NCBI发表的GenBank进行BLAST比对(登录号分别为MZ905367、MZ905368、MZ905365和MZ905366)，结果发现其与登录号为KM044006.1、HM989909.1和MG832459.1等20多个胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)rDNA-ITS序列的相似度均在99%以上。根据HT02、HT05、SHT1和SHT2菌株的形态特征及BLAST比对结果，将分离菌株鉴定为胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)。

2.2.2 核桃黑斑病 发病症状：核桃黑斑病主要发生在青果期，危害果实的青皮，也可危害叶片和嫩枝梢，严重时可造成落果和枝梢回枯。果实开始发病时在青果皮上出现褐色斑点，逐渐扩大为近圆形或不规则形，病斑黑色，有时凹陷，果实由外果皮向内腐烂，发病严重的果实易脱落。叶片发病初期病斑为圆形黑色小点，逐渐扩大为3～5 mm的圆形或近圆形病斑，后期病斑可形成穿孔，严重时叶片提早脱落。嫩枝梢上的病斑为圆形或长椭圆形，黑褐色，梢凹陷，病斑环绕枝梢后，易造成枝梢干裂和回枯(图 2-A和图2-B)。

病原菌分离及致病性测定：从病处分离得到优势菌株HT12，将HT12菌株接种到核桃的叶片、果实和嫩枝梢上，均可引起黑斑病症状，再分离获得菌株的形态特征与接种HT12菌株的形态特征一致，确定HT12为核桃黑斑病病原菌。

病原菌的形态特征：HT12菌株在28 ℃下PDA培养基上的菌落为圆形，边缘整齐，初为浅褐色，后变成褐色、深褐色；病菌的分生孢子黄褐色，倒棍棒状，有喙，具有横、纵分隔膜，主横隔膜数为1～6个，纵隔膜数为0～3个，孢子大小为(22.32±5.41)μm×(6.91±1.33)μm(图2-D)。因此，将HT12鉴定为链格孢菌(Alternariasp.)。

2.2.3 核桃枯枝病 发病症状：核桃枯枝病主要为害小枝，尤其是1年生的嫩枝梢，导致枝梢枯死。发病初期，顶梢幼嫩枝条的受害部位如芽、叶片和茎部出现水浸状褪绿病斑，后病斑扩大呈浅褐色至黑褐色，向枝端扩展，后期病部失水凹陷，变为明显的深褐色至黑色病斑，最后病部干缩，枝条枯死，枝条上的叶片逐渐变黄脱落，有时病死枯枝上密生红褐色至黑色的子实体，直径0.2～0.3 mm，为病原菌的分生孢子器(图3-A、图3-B和图3-C)。

病原菌分离及致病性测定：从核桃枯枝病的发病部位进行组织分离，得到3株优势菌株：HT03、HT04和HT10。将HT03、HT04和HT10菌株接种到核桃的枝条上均可引起枝枯病症状。其中，HT03和HT10菌株有伤口和无伤口接种均可引起发病，而HT04菌株仅有伤口接种引起发病。从发病部位再分离得到的菌株分别与接种的HT03、HT04和HT10菌株的形态特征一致。因此，确定HT03、HT04和HT10菌株均为核桃枯枝病病原菌。

病原菌的形态特征：HT03菌株在28 ℃下PDA培养基上的菌落为圆形，初为白色，较稀疏，生长约3 d可长出茂密的毛毡状白色气生菌丝，菌落较厚，长满平板时菌落可形成3～4个明显的同心轮纹，后期菌落颜色变为浅褐色，有黑色、坚硬的颗粒状物(直径1～2 mm)埋生其中，为病菌的分生孢子器，菌落背面灰白色(图3-F)；病菌有两种不同形态的分生孢子，其中，α型分生孢子单孢、无色，纺锤形或长椭圆形，大小为(8.95±3.45)μm×(3.15±0.10)μm，β型分生孢子单孢、无色，线状，直或一端稍弯，大小为(25.80±8.20)μm×(25.80×1.00)μm。HT04菌株在28 ℃下PDA培养基上的菌落初为白色，菌丝呈丝绒状，气生菌丝不发达，后菌落逐渐变为粉红色、玫瑰色，有3圈黄白色与玫瑰色相交替的同心轮纹，菌落背面产生玫瑰色色素，具与正面相同的同心轮纹；培养3 d后于菌落表面出现粉状物，为病菌的小型分生孢子，培养5～6 d时于菌落表面长出数个黄色油状的黏质团，为病菌的大型分生孢子堆；病菌的小型分生孢子卵形或椭圆形，链状着生，无隔膜，大小为(6.41±0.38)μm×(3.08±0.49)μm，大型分生孢子呈长镰刀形，聚生，6～8隔，孢子尖端及足细胞弯曲，大小为(60.93±3.15)μm×(5.73±0.74)μm(图3-H)。根据HT04菌株分生孢子的形状，初步判定其为镰刀菌属真菌。HT10菌株在28 ℃下PDA培养基上生长较快，菌落初为白色，菌丝棉絮状或绒毛状，气生菌丝茂盛，后菌落逐渐变为紫红色，菌落中央产生浅驼色至黄褐色菌丝，菌落背面有紫红色色素产生(图3-I)；病原菌缺乏小型分生孢子，大型分生孢子呈镰刀形或纺锤形，有1～3个隔，多数为3个隔，大小为(30.85±11.55)μm×(4.85±0.35)μm，顶细胞锥形，逐渐变窄，略弯曲，有时呈黄褐色(图2-J)。根据HT10菌株的分生孢子形状，初步判定其为镰刀菌属真菌。

A～C：自然发病症状；D：HT04菌株回接嫩梢的症状；E：HT10菌株回接叶梗的症状；F：HT03菌株的菌落；G：HT04菌株的菌落；H：HT04菌株的分生孢子；I：HT10菌株的菌落；J：HT10菌株的分生孢子 A-C：Symptoms in field；D：Symptom on twig inoculated by HT04；E：Symptom on stalk inoculated by HT10；F：Colony of HT03；G：Colony of HT04；H：Conidia of HT04；I：Colony of HT10；J：Conidia of HT10图3 核桃枯枝病的症状和病原菌形态特征Fig.3 Symptoms and pathogens morphological characteristics of walnut branch dieback

rDNA-ITS序列测定结果：对HT03、HT04和HT10菌株rDNA-ITS序列的PCR产物进行测序，获得的序列与NCBI发表的GenBank进行BLAST比对(登录号分别为MZ905165、MZ882156和MZ905171)，结果发现，HT03菌株的rDNA-ITS序列与登录号为KU837233.1的胡桃楸拟茎点霉(Phomopsisjuglandina)、登录号为MW228357.1、MN636327.1和MK398676.1等20多个间座壳属(Diaporthesp.，拟茎点霉的有性态)的同源序列相似度在99%以上；HT04菌株的rDNA-ITS序列与登录号为KM231809.1、HM054147.1和MH864595.1等10多个多隔镰刀菌(Fusariumdecemcellulare)的同源序列相似度在98%以上；HT10菌株的rDNA-ITS序列与登录号为MT228970.1、KP003943.1和MK079937.1等20多个禾谷镰刀菌(F.graminearum)同源序列的相似度在99%以上。根据形态特征和rDNA-ITS序列测定结果，将HT03菌株鉴定为胡桃楸拟茎点霉(P.juglandina)，HT04菌株鉴定为多隔镰刀菌(F.decemcellulare)，HT10菌株鉴定为禾谷镰刀菌(F.graminearum)。

2.2.4 核桃溃疡病 发病症状：核桃溃疡病主要为害核桃树干及主侧枝基部，通常发生在基部至基部以上1.0 m处。发病初期在树皮表面出现红褐色至紫褐色的近圆形病斑，病斑逐渐扩展呈不规则的长条形，湿度大时病斑可形成水泡，水泡破裂后有褐色粘液渗出，病斑下部及周围呈水渍状，病斑失水后干枯，中央为黑褐色，四周为浅褐色，病健交界处不明显；后期病斑上散生很多小黑点，为病菌的分生孢子器；切开树皮，可见发病部位呈褐色至黑褐色坏死，病健交界处明显；严重发病的树干，病斑相连可造成树皮大面积溃烂、开裂，病斑环绕树干，导致整个侧枝甚至全株枯萎(图4-A、图4-B、图4-C)。

病原菌分离及致病性测定：从发病部位分离到1株优势菌株HT21。将HT21菌株接种到核桃苗枝条基部可引起溃疡病症状，再分离获得菌株的形态特征与接种菌株一致，因此，确定HT21菌株为核桃溃疡病病原菌。

病原菌的形态特征：HT21菌株在28 ℃下PDA培养基上生长较快，3～4 d可布满整个培养基平板，菌落初为白色，后逐渐变黑色，气生菌丝发达，通常生成菌丝束(图4-D)；分生孢子无色，单胞，透明，梭形或近长椭圆形，两端梢尖或钝圆，内有油球状物，孢子大小为 (22.15±5.13)μm×(6.62±0.49)μm，与群生小穴壳(Dothiorellagregaria，无性态)的形状相似(图4-E)。

A～C：症状；D：HT21菌株的菌落；E：HT21菌株的分生孢子 A-C：Symptoms；D：Colony of HT21；E：Conidia of HT21图4 核桃溃疡病的症状和病原菌形态特征Fig.4 Symptoms and pathogens morphological characteristics of walnut canker

rDNA-ITS序列测定结果：对HT21菌株rDNA-ITS序列的PCR产物进行测序，获得的序列与NCBI发表的GenBank进行BLAST比对(登录号为MZ906610)，结果表明，HT21菌株的rDNA-ITS序列与登录号为LC317472.1、KC492477.1和KC492466.1等30多个葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)ITS序列的相似度在99%以上 。根据病菌的形态特征、BLAST比对结果，参考赵玉美等[9]、Chen等[22]的描述，将核桃溃疡病病原菌HT21菌株鉴定为葡萄座腔菌(B.dothidea，有性态)，其无性态为群生小穴壳(D.gregaria)。

2.2.5 核桃根腐病 发病症状：核桃根腐病为害核桃根部，造成根部腐烂。发病初期，病株的叶片出现类似缺水的症状，中期叶片退绿、黄化、卷曲、萎蔫，枝条不发芽，植株生长不良，最后整个植株枯死。发病早期挖开植株根部，可见部分侧根发黑腐烂，植株地上同一侧的相应部位枝叶长势弱，发病严重的植株，整个根系发黑腐烂。纵剖发病植株根茎部，可见木质部有褐变症状(图5-A、图5-B和图5-C)。

病原菌分离及致病性测定：从病部分离得到2株优势菌株HT23和HT26。将这2株菌株接种核桃小苗的根部，可引起核桃小苗根腐，小苗枯死；再分离可获得同样的菌株，因此，确定HT23和HT26菌株为核桃根腐病的病原菌。

病原菌的形态特征：HT23菌株在28 ℃下PDA培养基上的菌落圆形，菌丝初期白色，后黄褐色，气生菌丝少；病原菌有大、小两种分生孢子，其中，小型分生孢子为卵形，多数无隔，少数1个隔，大小为(9.87±2.23)μm×(6.82±1.03)μm，大型分生孢子为镰刀形，具1～3个分隔，大小为(32.08±6.04)μm×(4.55±0.98)μm。HT26菌株在28 ℃下PDA培养基上的菌落圆形，菌丝初期呈白色，棉絮状，后呈淡青莲色(图5-D)；病原菌有大、小两种分生孢子，其中，小型分生孢子数量多，长椭圆形或卵形，多数无隔，少数1个隔，大小为(6.10±1.01)μm×(2.96±0.46)μm，而大型分生孢子数量很少，镰刀形，具2～3个分隔，多数3个分隔，大小为(24.34±3.56)μm×(3.12±0.25)μm(图5-E)。

rDNA-ITS序列测定结果：对HT23和HT26菌株rDNA-ITS序列的PCR产物进行测序，获得的序列与NCBI发表的GenBank进行BLAST比对(登录号分别为MZ905375和MZ905374)，结果表明，HT23菌株的rDNA-ITS序列与腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)(登录号分别为MT107069.1、KP326582.1和MG489960.1)ITS序列的相似度在99%以上；HT26菌株的rDNA-ITS序列与尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)(登录号分别为MK590412.1、MK966308.1、MK910069.1)ITS序列的相似度在99%以上。根据病菌的形态特征和BLAST比对结果，参考相关文献，将HT23菌株鉴定为腐皮镰刀菌(F.solani)，将HT26菌株鉴定为尖孢镰刀菌(F.oxysporum)。

2.2.6 核桃白粉病 发病症状：核桃白粉病主要为害核桃叶片。受害叶片正面出现边缘不清晰的退绿黄斑，叶片背面覆盖一层明显的白粉层，此为病菌的分生孢子、分生孢子梗和菌丝；在秋季，白粉层上产生黄白色至黑褐色的小颗粒状闭囊壳，属病原菌的有性阶段(图6-A和图6-B)。

A～C：症状；D：HT26的菌落；E：HT26的大、小分生孢子 A-C：Symptoms；D：Colony of HT26；E：Conidia of HT26图5 核桃根腐病的症状和病原菌形态特征Fig.5 Symptoms and pathogens morphological characteristics of walnut root rot

A～B：叶片背面/正面症状；C～D：病原菌的分生孢子 A-B：Symptom on the abaxial/adaxial surface of leaf；C-D：Conidia of pathogens图6 核桃白粉病的病叶和病原菌形态特征Fig.6 Symptoms and pathogens morphological characteristics of walnut powdery mildew

病原菌的形态特征：病原菌的分生孢子梗从病斑上外生的菌丝垂直向上生长，单条，微弯曲，无色，内具0～3个隔，顶端单个着生分生孢子；分生孢子呈瓜子形，无色，单胞，表面粗糙，顶部具明显的乳突，大小为(9.80±1.75)μm×(4.58±0.52)μm(图6-C和图6-D)；闭囊壳球形，黑褐色，附属丝呈球针状。根据病害的症状和病菌的形态特征，将核桃白粉病的病原鉴定为胡桃球针壳(Phyllactiniajuglandis)，无性态为拟卵孢属(Ovulariopsis)。

3 讨 论

汪筱雪等[15]鉴定发现，广西西北部核桃病害主要有腐皮镰刀菌引起的根腐病、胡桃楸拟茎点霉引起的枝枯病、茎点霉引起的黑斑病和胶孢炭疽菌引起的炭疽病4种。而本研究调查和鉴定结果表明，广西石漠化地区核桃主要病害有6种，其中，除未分离到茎点霉黑斑病外，另外3种与汪筱雪等[15]鉴定发现的病害相同；还鉴定到链格孢菌引起的黑斑病、多隔镰刀菌和禾谷镰刀菌引起的枝枯病、葡萄座腔菌引起的溃疡病、尖孢镰刀菌引起的根腐病及胡桃球针壳引起的白粉病。可见，广西石漠化地区的核桃病害种类较多，一些病害如枝枯病和根腐病还存在多种病原菌混合侵染现象。

本研究分离到的核桃枝枯病病原菌除胡桃楸拟茎点霉外，还首次分离到多隔镰刀菌和禾谷镰刀菌，而国内报道引起核桃枝枯病的病原菌还有矩圆黑盘孢菌(Melanconiumoblongum)、辣椒拟茎点霉(P.capsici)和新壳梭抱(Neofusicoccumparvum)等[23-25]，说明在广西石漠化地区特定的地形、地域和气候环境等条件下，引起枝枯病的病原菌与其他地方存在一定差异。本研究观察发现，腐皮镰刀菌根腐病主要发生在排水不良、核桃植株易受水淹的核桃园，而尖孢镰刀菌根腐病在排水良好的核桃果园中也有发生；从核桃根腐病病根中分离到腐皮镰刀菌和尖孢镰刀菌2种病原菌，与汪筱雪等[15]对广西金城江区、凤山县和乐业县及胡云飞和郭新峰[26]对安徽省宁国市及宋嘉伟[27]对杭州市临安山核桃的研究结果一致，说明腐皮镰刀菌和尖孢镰刀菌也是引起广西石漠化地区核桃根腐病的病原菌之一。已有报道表明，引起核桃白粉病的病原菌有核桃叉丝壳菌(Microsphaerajuglandis或M.yamadai)和胡桃球针壳[28-29]，但曲文文等[8]、杨克强等[29]报道引起核桃白粉的病菌仅有核桃叉丝壳1种，而本研究镜检发现，引起广西凤山县核桃白粉病的病原菌为胡桃球针壳，无性态为拟卵孢属，与曲文文等[8]、杨克强等[29]的研究结果不一致，说明广西石漠化地区核桃白粉病的病原菌与其他地区存在一定差异。张知晓等[10]、汪筱雪等[15]、Fernandes等[30]、肖波等[31]研究认为，核桃黑斑病是多种病菌复合侵染的结果，其病原菌有核桃黄单胞杆菌(Xanthomonascampestrispv.Juglandis)、茎点霉、成团泛菌(Pantoeaagglomerrans)和链格孢菌，但本研究仅分离到核桃黑斑病的1种病原菌，即链格孢菌，可能与开展研究的地域及病害采集时间不同有关。

本研究观察还发现，不同核桃品种对不同病害的抗感性差异较明显，如娘青、三台核桃和凤优1号较抗炭疽病，而云新和香玲高感炭疽病。后续应进行石漠化地区核桃品种抗病性评价，为广西石漠化地区合理引种优良核桃品种提供科学依据。

4 结 论

广西石漠化地区核桃主要病害有胶孢炭疽菌引起的炭疽病，链格孢菌引起的黑斑病，胡桃楸拟茎点霉、多隔镰刀菌和禾谷镰刀菌引起的枝枯病，葡萄座腔菌引起的溃疡病，腐皮镰刀菌和尖孢镰刀菌引起的根腐病，胡桃球针壳引起的白粉病。其中，多隔镰刀菌与禾谷镰刀菌引起的核桃枝枯病为首次发现。在这些病害中，发生最严重的是炭疽病，其次是黑斑病和枯枝病，生产上需进行重点防控；其他病害总体上发生较轻，但在局部地区发生严重时也需进行防控。

致 谢：凤山县核桃科研开发中心张清毅、苏方贵、梁钟方和罗琛，河池市核桃研究所谢代祖和韦林，天峨县林业局刘玲和罗智辉，南丹县核桃产业发展中心刘顺和和黄敏，东兰县林业局韦锦山和韦兰，广西农业科学院植物保护研究所廖世纯、王凤英和覃武参加了部分调查工作，在此一并致谢!