靶向高通量测序检测卵巢癌患者易感基因突变与临床特征的相关性研究

马占忠 ，许红雁，胡红波，刘玉兰，陈伟娟，肖凤金，梁庆雲，叶美娴

（汕头大学医学院附属粤北人民医院 a. 检验科；b. 妇科；c. 生物样本库，广东韶关 512026）

卵巢癌是严重危害女性健康的三大恶性肿瘤之一，病死率居妇科恶性肿瘤首位，据WHO 报道：2018年全球新增卵巢癌患者约29.54 万例，死亡18.4 万例[1-2]。由于缺乏早期特异性标志物及临床症状，卵巢癌难以早期发现，大多数患者确诊时已到晚期[3]，而且预后极差，总体5年生存率仅有30%～40%[4-5]。BRCA1/2 基因突变会增加患卵巢癌的风险，约20%的卵巢癌患者存在BRCA1/2 基因突变[6-8]。因此，寻找卵巢癌早期检测的新靶点及防治策略是全球关注的焦点和难点。卵巢癌中10%～15%为遗传性卵巢癌[9]，这部分人群可以通过基因检测做到早期诊断和精准靶向用药治疗，降低卵巢癌的死亡率。并通过评估其家属的患癌风险，采取科学干预措施，降低卵巢癌的发病率。在精准医学时代，下一代测序技术（next-generation sequencing, NGS)在临床上的广泛应用，对卵巢癌的个体化诊疗产生了深远影响[10]。本研究利用靶向高通量基因测序技术对21 种卵巢癌易感基因进行测序。继而分析携带胚系基因突变和临床特征的相关性，为卵巢癌的个体化精准诊疗和预防提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2018年1月～2020年12月在粤北人民医院就诊的35 例卵巢癌患者的外周血标本和临床资料，中位年龄50.2 岁（范围31～74 岁），所有病例均经过组织病理学确诊为卵巢癌。肿瘤分期根据国际妇产科联合会（FIGO）和世界卫生组织（WHO）标准。入组患者进行BRCA1/2 等21 种易感基因的胚系突变检测，从病历中收集患者临床病理、家族史、诊疗等信息。本研究经粤北人民医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂 Covaris LE220 超声波破碎仪，Agilent 2100 Bioanalyzer 生物分析仪，Qubit3.0 荧光定量分析仪、ABI StepOne 荧光定量PCR 仪和Illumina HiSeq2500 高通量测序仪等。QIAamp DNA Blood Midi Kit 提取DNA 试剂盒，华大基因文库构建和测序试剂盒。

1.3 方法

1.3.1 基因组DNA 提取：采集患者静脉血5ml，EDTA-K2抗 凝， 按 照QIAamp DNA Blood Midi Kit 试剂盒说明书提取人外周血单个核细胞基因组DNA。

1.3.2 文库构建：将提取的基因组DNA 利用Covaris LE220 超声波破碎仪打断成200 ～250 bp的片段，进行Ampure Beads 纯化，将纯化后的DNA 片段末端修复、加“A”以及加接头反应，完成文库构建。

1.3.3 杂交捕获：Non-Captured 样品进行LM-PCR反应、纯化，利用基因片段捕获探针，65℃杂交捕获24h，杂交结束后进行洗脱，随后进行Captured 样品的LM-PCR 反应。文库经Agilent 2100 Bioanalyzer生物分析仪和 ABI StepOne 荧光定量PCR 仪检测片段大小和浓度。

1.3.4 基因测序：使用Illumina HiSeq2500 基因测序仪进行双向测序，测序覆盖目标基因外显子及其邻近±20bp 内含子区，包括BRCA1，BRCA2，CHEK2，PALB2，BRIP1，TP53，PTEN，STK11，CDH1，ATM，BARD1，MLH1，MRE11A，MSH2，MSH6，MUTYH，NBN，PMS1，PMS2，RAD50 和RAD51C 共21 种基因。

1.3.5 生物信息学分析：用Illumina Pipeline software(v 1.3.4) 对原始数据进行自动处理和分析，用BWA(Burrows Wheeler Aligner)软件与HG19 进行序列比对，同时评价序列捕获效果。用SOAPsnp软件和Samtools 软件进行SNV(single nucletide variant) 和Indel(insertion and deletion)的分析，查询COSMIC(https://cancer.sanger.ac.uk /cosmic)，dbSNP(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)，TP53 数据库(http://p53.iarc.fr/Protocolsand Tools.aspx), Hap-Map, 1000 human genome dataset 和 database of 100 Chinese healthy adults 等数据库，对基因突变位点进行归类和注释。

1.4 统计学分析 采用SPSS22.0 软件进行统计学分析。计数资料以n（%）表示，组间比较采用卡方检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 卵巢癌患者临床病理特征 35 例卵巢癌患者中，年龄＜50 岁12 例（34.3%），年龄≥50 岁23例（65.7%）；组织类型中高级别浆液性卵巢癌27例（77.1%），其他类型8 例（22.9%）；FIGO 分期I～II 期9 例（25.7%），III～IV 期26例（74.3%）；有肿瘤家族史15 例（42.9%），CA-125中位数755.3U/ml（范围7.9～10 000.0U/ml）。

2.2 卵巢癌患者胚系基因突变分布 见表1。35例卵巢癌患者中检出已知致病突变19 例，突变率54.3%，其中BRCA1 基因突变7 例，BRCA2 基因突变4 例，RAD51C 基因突变2 例，CHEK2，ATM，RAD50，MSH2，MRE11A 和TP53基因突变各1 例，这19 种突变类型中有17 种已在公共数据库中有报道，另外，发现两种新的基因突变，包括BRCA1 基因c.438delC 和RAD51C 基因c.390_391delAA。

表1 卵巢癌患者胚系基因突变分布

2.3 主要基因突变与临床病理特征的关系 见表2。卵巢癌患者多以高级别浆液性卵巢癌晚期为主，BRCA1 和BRCA2 是卵巢癌最主要的胚系突变基因。BRCA1/2 基因突变和组织类型相关（P=0.034），和家族史显著相关（P=0.003），与年龄和FIGO 分期无显著相关性（P>0.05）。

表2 主要基因突变与临床病理特征的相关性分析[n=35, n(%)]

3 讨论

本研究结果发现卵巢癌患者易感基因突变率为54.3%，BRCA1 基因突变率最高(20.0%)，其次是BRCA2 基因突变率(11.4%)，BRCA1 和BRCA2 是卵巢癌中最主要的胚系突变基因，并且该基因突变与遗传性卵巢癌显著相关。检测出的突变类型有框移突变、剪接突变和错义突变，所有突变均为杂合子和常染色体显性遗传。其中由基因缺失引起的框移突变占42.1%，该类突变可能导致基因编码蛋白异常。新发现的BRCA1 基因c.438delC 和RAD51C基因c.390_391delAA 突变在公共数据库中尚未见报道，有待于进一步扩大病例数深入研究。另外，研究发现BRCA1/2 基因突变频率高，且无热点突变，所以传统的荧光定量PCR 不适宜做BRCA1/2基因突变检测，测序是检测此类基因突变的最佳技术手段。

卵巢癌的发生本质上是基因突变和免疫逃逸所致，对高危人群进行易感基因筛查是卵巢癌早期诊断的有效手段[11]。本研究结果也证实了BRCA1/2 基因突变与遗传性卵巢癌发病密切相关。BRCA1 和BRCA2 分别定位在人类染色体17q21 和13q12，具有调节细胞周期、调控转录及DNA 修复等作用，基因发生突变使得细胞的正常调节失活，引起细胞异常生长，最终发生肿瘤[12-13]。一般人群中卵巢癌终生发病风险约为1.5%，而BRCA1和BRCA2 基因突变携带者患卵巢癌的风险分别是25%～65%和15%～20%[14]。美国国家综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network, NCCN）在遗传性乳腺癌及卵巢癌综合征检测标准中，建议应对有家族史的人群检测BRCA1 和BRCA2 基因，对于携带已知致病性突变的人群应加强健康管理，以利于早期发现和干预[15]。

卵巢癌肿瘤细胞和胚系细胞中主要的突变基因有差异。KWONG 等[16]应用高通量测序检测卵巢癌患者体细胞易感基因，排在前五的突变是TP53(52.9%)，KRAS(23.5%)，PIK3CA(11.8%)，BRCA1(5.9%) 和RB1(5.9%)。GARZIERA 等[17]在遗传性卵巢癌肿瘤细胞中检出最主要的突变是TP53(72.1%)， KRAS (8.9%)，FBXW7(3.8%)，PTEN (3.8%)和 PIK3CA (3.8%)，研究结果显示肿瘤细胞中以TP53 突变为主，而胚系细胞中则以BRCA1/2 突变为主[18]。2013年5月14日，国际影星安吉丽娜·朱莉(Angelina Jolie)公布了她检测到BRCA1 基因有突变，加之母亲患乳腺癌，评估其罹患乳腺癌和卵巢癌的风险分别高达87%和50%的情况下，她选择了双侧乳房切除术预防肿瘤的消息[19]。此事除明星效应引起全球关注外，也引发了医学界对预防性器官切除及医疗指征的热议[20]。目前，国外医疗机构已广泛开展遗传性肿瘤的基因测序和遗传咨询[21]，国内肿瘤基因测序在临床上的应用也取得了一定的进展[22-23]。随着高通量基因测序在遗传性肿瘤防治中的应用，使得肿瘤的防治有了重大突破，肿瘤患者的生存获益有了质的飞跃[24-26]。基于高通量测序技术的临床研究必将极大地推动以基因大数据与个体化诊疗为特征的精准医学的发展，影响和改变我们的临床实践，具有临床推广应用前景。