支气管哮喘患者外周血PD-1，IFN-γ，IL-4与Th细胞及T细胞亚群水平表达的临床意义研究

左俊丽，白巨星(西安国际医学中心医院呼吸与危重症医学科 ,西安 710100)

关键字:哮喘；程序性死亡分子1；干扰素-γ；白介素-4；Th 细胞

哮喘为一种气道慢性炎症性疾病，由嗜酸性粒细胞、T 细胞等多种细胞和细胞组分参与，导致反复的气道高反应性和气道重塑，常表现为气短、胸闷、气促和咳嗽的反复发作，接触外界刺激时易发作，常于夜间和清晨发作或加剧[1-2]。近年来，哮喘的发病率和死亡率呈持续增加趋势，目前难以彻底治愈，主要以防治为主，早期诊断早期干预对哮喘的控制和治疗有重要的意义[3]。辅助性T 细胞(helper T cell)，简称为Th 细胞，在机体的免疫系统中发挥重要作用，能分泌多种细胞因子，产生多种白细胞介素，参与激活被感染细胞溶酶体酶[4-5]。白细胞介素-4(interleukin-4, IL-4)和干扰素- γ(interferon-γ, IFN-γ)是Th1 和Th2 细胞的特征性细胞因子，在哮喘发病的多个环节中均有参与[6]。程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1, PD-1）为一种55 kDa 的跨膜蛋白，在细胞毒性T 淋巴细胞相关蛋白4 胞膜外区和氨基酸有24%的同源性，PD-1 为负性协同刺激受体之一，能表达于活化的T细胞表面[7-8]。Th 细胞、PD-1，IL-4 和IFN-γ 在气道炎症反应中均发挥了重要作用。因此本研究通过测定并比较支气管哮喘患者与正常成人肺功能以及血清Th 细胞、PD-1，IL-4，IFN-γ 水平以及T细胞亚群的差异，研究以上指标在支气管哮喘发病中的作用及意义，具体如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2019年9月～2020年9月就诊于我院的80 例哮喘患者为研究组，男性37例，女性43 例，平均年龄49.2±7.3 岁，病程1～9年，FEV1（70.94±8.43）%，FEV1/预计值百分比（72.98±10.42）%。另以同期在本院体检的80 例健康成人为对照组，其中男性38 例，女性42 例，平均年龄48.9±7.5 岁，FEV1（103.78±11.56）%，FEV1/预计值百分比（89.23±7.32）%，两组基本信息性别构成、年龄等经分析无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

研究组纳入标准：①符合诊断标准《支气管哮喘防治指南》[9]；②年龄≥20 岁；③在入组前一个月内未使用糖皮质激素类药物；④检测前未使用β2 受体激动剂。

排除标准：①患有脓毒血症、败血症等疾病者；②易过敏体质者；③并发心肺疾病、寄生虫疾病等；④近期有手术、创伤和感染者。

本研究已获得医院伦理委员会的准许，患者及家属均充分了解研究内容并签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂 瑞士ndd EasyOne 便携式肺功能仪；贝克曼库尔特Optima XPN 超速离心机（型号：XPN-100/90/80）；人PD-1，IFN-γ 和IL-4 酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；克隆抗体间接免疫荧光抗体（赛默飞世尔科技）；荧光单细胞内染色试剂盒（美国BIO-SOURCE 公司）；单克隆抗体间接免疫荧光试剂盒（美国赛默飞世尔科技公司）等。

1.3 方法

1.3.1 肺功能测定: 对研究组和对照组的肺功能进行肺功能检测，采用肺功能仪检测两组第1 秒钟用力呼气容积（FEV1）和FEV1 占预计值%并进行比较。

1.3.2 PD-1，IFN-γ 和IL-4 的检测：清晨采集两组研究对象的空腹静脉血3 ml，室温下放置30min后，于4 ℃下3 000r/min 离心15 min，取上层血清于-80℃下保存待检。采用ELISA 法检测PD-1，IFN-γ和IL-4表达水平，严格按试剂盒说明书操作。

1.3.3 Th 细胞和T 淋巴细胞亚群检测:两组研究对象均采集肝素抗凝血2 ml，采用荧光单细胞内染色法检测Th1/Th2，采用单克隆抗体间接免疫荧光法检测T 淋巴细胞亚群，均采用对应试剂盒并按照试剂盒说明书进行检测。

1.4 统计学分析 以 SPSS 19.0 软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，使用t检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清PD-1，IFN-γ 和IL-4 的水平及肺功能指标FEV 和FEV1/预计值百分比比较 见表1。对两组对象的血清PD-1，IFN-γ 和IL-4 的表达水平进行检测并比较，研究组的PD-1 和IFN-γ 水平均显著低于对照组，研究组的IL-4 表达水平显著高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。研究组肺功能指标FEV1 和FEV1/预计值百分比（FEV1%pred）均显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 两组血清PD-1，IFN-γ 和IL-4 的水平及肺功能指标FEV 和FEV1/预计值百分比比较（±s）

表1 两组血清PD-1，IFN-γ 和IL-4 的水平及肺功能指标FEV 和FEV1/预计值百分比比较（±s）

项 目 对照组(n=80) 研究组(n=80) t P PD-1（%） 18.93±8.45 0.18±0.04 19.847 ＜0.001 IF N-γ（pg/ml ） 803.54±521.98 587.75±294.37 3.221 0.002 IL-4（pg/ml） 768.36±573.65 1216.87±822.84 3.999 ＜0.001 FEV1(%) 103.78±11.56 70.94±8.43 20.530 ＜0.001 FIV1/%Pred(%) 89.23±7.32 72.98±10.42 11.414 ＜0.001

2.2 两组外周血Th 细胞占比情况比较 见表2。对两组的Th 细胞表达进行检测分析，研究组Th1细胞占比以及Th1/Th2 比值显著低于对照组，Th2细胞占比显著高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表2 两组外周血Th 细胞占比情况比较（±s）

表2 两组外周血Th 细胞占比情况比较（±s）

项目 对照组(n=80)研究组 (n=80) t P Th1（%） 16.43±2.49 11.32±2.19 13.783 ＜0.001 Th2（%） 16.02±5.43 19.79±4.32 4.860 ＜0.001 Th1/Th2 1.02±0.23 0.57±0.19 13.492 ＜0.001

2.3 两组外周血T细胞亚群占比情况比较 见表3。对两组的T 细胞亚群进行检测分析，两组CD3+水平无显著差异（P＞0.05），研究组CD4+水平显著高于对照组，CD8+水平和CD4+/CD8+比值显著低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表3 两组外周血T 细胞亚群占比情况比较（±s）

表3 两组外周血T 细胞亚群占比情况比较（±s）

项目 对照组(n=80)研究组(n=80) t P CD3+（%） 61.13±3.46 60.45±4.11 1.132 0.259 CD4+（%） 33.01±1.55 36.51±2.19 11.668 ＜0.001 CD8+（%） 29.97±1.28 27.13±2.37 9.431 ＜0.001 CD4+/ CD8+ 1.17±0.23 1.45±0.14 9.301 ＜0.001

3 讨论

哮喘的发病过程涉及了T 淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞以及肥大细胞等，其中T 淋巴细胞发挥了重要的免疫调节作用。Th 细胞平衡失调学说为一个发病机制研究热点，Th 细胞对B 淋巴细胞合成IgE 有促进作用，而抑制性T 细胞可抑制IgE 合成，有研究发现哮喘患者血液中Th 细胞增多，功能增强[10-11]。

Th 细胞根据其表面标志、转录因子和所分泌细胞因子可分为Th1，Th2，Treg 和Th17 等亚群，其中Th1 和Th2 细胞数目和功能的失衡在哮喘发病过程中影响较大[12]。Th1可以产生IFN-γ和IL-2等，主要作用是抵御细胞内感染以及细胞免疫应答，与多种器官的特异性自身免疫病有关；Th2 可以产生IL-4，IL-5 和IL-6 等，主要用于防御细胞外感染，其表达异常与超敏反应有关[13]。T 淋巴细胞主要通过IL-4 促进IgE 的合成，Th1 分泌的IFN-γ 可抑制Th2 的功能从而抑制IgE 的合成，由此说明Th1/Th2 细胞的失衡是哮喘发病的重要因素之一[14]。

IL-4 是由Th2 细胞产生的可以促进体液免疫并抑制细胞免疫的细胞因子，可以通过促进IgE 而引起肥大细胞和嗜碱性粒细胞的增多，嗜酸性粒细胞的生长分化以及富集，使Th2 免疫反应过强；又可抑制Th1 分泌，减少IFN-γ 的产生，使Th1 反应低下[15]。IFN-γ 是由Th1 产生的细胞因子，在机体一氧化氮途径中能舒张气管，并抑制平滑肌细胞DNA 的合成[16]。PD-1 为一种55 kDa 的跨膜蛋白，在CTLA-4 胞膜外区和氨基酸有24%的同源性，PD-1 为负性协同刺激受体之一，能表达于活化的T细胞表面。PD-1 有PD-L1 和PD-L2 两个配体，其中PD-L1 表达于单核细胞，活化后PD-L1 表达量下调，而PD-L2 在激活后被诱导[17]。PD-L1 能抑制Th1，使IL-4 生成增多，增强气道高反应性，而PD-L2 能抑制Th2 增加IFN-γ 的表达，降低气道高反应性。PD-1/PD-L1 通路可通过抑制Th17 细胞的免疫应答反应限制哮喘的严重程度，因此哮喘的发生可能与PD-1/PD-L1 调节轴缺陷有关[12]。PD-1/PD-L1 可以维持T 细胞的稳态，PD-1 缺乏时外周免疫耐受状态被破坏，引起多种免疫疾病的发生，PD-1 是免疫应答负性调节的重要因子。本研究中，研究组的PD-1 和IFN-γ 水平均显著低于对照组，IL-4 表达水平显著高于对照组（P＜0.05），表明PD-1 的低表达可能与哮喘患者体内T 细胞的异常活化、呼吸道特异性炎性反应有关，与文献[12]结论一致。另外，本研究两组外周血Th 细胞和T 细胞亚群占比情况比较结果表明：哮喘的发生伴随着淋巴细胞亚群比例的失衡，因此CD4+/CD8+比值的稳定在维持细胞免疫水平中有重要作用，与相关研究结论一致[18]。

综上所述，哮喘患者血清PD-1 水平降低，IL-4 水平增高，抑制了Th1 细胞产生IFN-γ，并使Th1/Th2 和CD4+/ CD8+平衡状态破坏，各细胞及细胞因子相互制约、相互调节，构成复杂的调节网络，对哮喘的诊断治疗有重要意义。