咪鲜胺防治菠萝黑腐病效果评价

沈会芳，杨祁云，蒲小明，张景欣，孙大元，林 伟，陈雨生，林壁润，李晓刚

（1广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室，广州 510640；2湛江市农业科学研究院，广东 湛江 524094；3雷州市农业科学研究所，广东 湛江 524267；4济南海关动植物检疫处，济南 250002）

0 引言

菠萝(Ananas comosus)是世界第三大热带水果，菠萝产业是华南热区的特色产业，是热区农业经济的支柱产业之一。黑腐病是菠萝常见采后病害，在国内主要菠萝产区广东、海南、广西和福建等都有发生，有的产区发病率高达30%～40%[1]。广州栽培的‘卡因’菠萝，果实在常温下贮藏14天后，发病率高达50%～60%，造成严重经济损失[2]。因此，评价药剂对病害的防治效果，在此基础上优化药剂防治技术，可为病害防治提供简单实用的技术。菠萝黑腐病由奇异根串珠霉(Thielaviopsis paradoxa)侵染引起[3-4]。病菌在12～38℃范围内可生长，适温是25～30℃，生长pH 3～8，最适pH 5～8[5-6]。病菌主要由果实伤口侵入为害[7-8]，菠萝采收前，天气温暖潮湿适于真菌的生长繁殖，潮湿后干旱易导致裂口，为病菌侵入提供有利条件，加重病害发生。包装及运输过程中损伤越大，为病菌提供侵入途径越多，病害的发生越重[4]。采前打顶在果实上留下伤口，是采后菠萝黑腐病发生危害的重要原因[2]。因此，采前不打顶，采收及运输时避免机械损伤，均有较好的预防效果。低温不利于病菌侵入，12℃低温贮藏，可显著减少菠萝黑腐病的发生[2]。病菌在38℃以上不能生长，热水处理可抑制病害发生，Wijeratnam等[9]用54℃热水处理菠萝果实3 min后，10℃贮藏21天，再在室温下贮藏2天，菠萝未发生黑腐病。利用微生物菌剂或植物提取物抑制病害也是研究热点，Reyes等[10]发现毕赤酵母(Pichia guilliermondii)可降低黑腐病菌孢子萌发率、芽管长度和病菌干重，使发病率减半，对病害防治效果与8～10℃贮藏相当。Wijesinghe等[11-12]筛选获得棘孢木霉(Trichoderma asperellum)，可抑制菌丝的生长，防控病害，处理后菠萝在pH、可溶性固形物等方面与对照无显著差异。Souza等[13]利用苦瓜提取物防控黑腐病，效果与噻菌灵相当，对果实采后品质无影响。另外，谷会等[14]发现1%氯化钙处理可明显抑制病原菌的产孢，对病害有一定的防治效果。唐友林等[2]报道用蜡乳剂、赤霉素GA3分别加杀菌剂多菌灵、仲丁胺或苯来特浸果处理，可明显降低贮藏期黑腐病发生率，但赤霉素GA3的不当使用，会诱发菠萝另一采后病害黑心病的发生。采后菠萝黑腐病危害严重，迫切需要一种能有效控制病害的方法。物理及生物防治技术还处在实验室研究阶段，无法应用于实际生产，至今，化学防治仍是该病的主要防治技术。笔者评价新型高效低毒杀菌剂对黑腐病菌的抑杀效果，优化其对菠萝黑腐病使用技术，旨在为病害防治提供简单实用的技术。

1 材料与方法

1.1 实验时间、地点

研究于2017年5月—2020年2月在广东省植物保护新技术重点实验室进行。

1.2 实验材料

菠萝黑腐病菌奇异根串珠霉(Thielaviopsis paradoxa)分离自海南省乐东县菠萝样本，保存于广东省农业科学院植物保护研究所。培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)，配方参照文献[15]。药剂包括咪鲜胺、代森锰锌、戊唑醇、嘧菌酯、百菌清、苯醚甲环唑、甲基硫菌灵标准样品购自上海市农药研究所。250 g/L咪鲜胺乳油制剂，苏州富美实植物保护剂有限公司生产；菠萝品种为‘卡因’，在菠萝收获期，自广东徐闻菠萝种植区采收，菠萝结果至采收前未喷施任何农药。

1.3 7种杀菌剂对菠萝黑腐病菌的生物活性测定

将供试原药稀释，取1 mL药液加入49 mL PDA培养基(45℃)中，使培养基中杀菌剂浓度为实验所需系列浓度。每50 mL培养基平均倒入3个平皿，制成含药平板。用直径6 mm打孔器切取病菌菌丝块，接入平板中央，每处理5个培养皿，3次重复，以不加药为对照，28℃培养，待对照快长满平皿后，十字交叉法测定菌落直径，计算药剂抑制率和线性回归方程及相关参数。

1.4 咪鲜胺对菠萝黑腐病菌生长发育的影响

用无菌水洗下PDA平板上病菌分生孢子，制成106个/mL的孢子悬浮液。按1.3方法制备含药培养基，使咪鲜胺浓度分别为0、0.05、0.005 μg/mL，吸取2 mL含药培养基涂在无菌玻片上，凝固后滴0.1 mL孢子悬浮液，涂抹均匀。每处理20片玻片，3次重复。玻片放入培养皿，28℃培养4、8、12、16、20、24 h 时，各处理均取出3片玻片，用显微镜观察孢子萌发、菌丝生长及孢子形成情况。在培养8 h时，每处理随机统计300个孢子的萌发情况，计算孢子萌发率。

1.5 评价不同浓度咪鲜胺对菠萝黑腐病的防治效果

将咪鲜胺乳油制剂用清水稀释至有效成分为0、62.5、125、250、500、1000 μg/mL，将刚采收后菠萝果实在药剂中浸泡5 min后取出，自然晾干，置于28℃贮藏，每处理40个果实，3次重复。处理后16天观察记录黑腐病的发生情况，计算发病率和病情指数。

1.6 500 μg/mL咪鲜胺不同浸果时间对菠萝黑腐病的防治效果

制备500 μg/mL咪鲜胺药液，将菠萝果实在药剂中分别浸泡0、1、2、3、4、5 min后取出自然晾干，置于28℃贮藏，每处理40个果实，3次重复。处理后16天观察记录病害的发生情况，计算发病率和病情指数。

1.7 500 μg/mL咪鲜胺浸果1 min对菠萝黑腐病的防治效果

将菠萝果实在500 μg/ml咪鲜胺药液中浸泡1 min后自然晾干，置于28℃贮藏，以清水浸泡果实为对照，每处理40个果实，3次重复。处理后每隔4天观察记录菠萝黑腐病的发生情况，计算发病率和病情指数。

1.8 500 μg/mL咪鲜胺浸果1 min处理后在菠萝果实中的残留

500 μg/ml咪鲜胺药液浸果1 min后自然晾干，28℃贮藏，取处理后2 h、1天、2天、3天、4天、5天的健康果实送至农业部蔬菜水果质量监督检验测试中心（广州），根据行业标准《水果中咪鲜胺残留量测定气相液谱法》(NY/T 1456—2018)检测样品中咪鲜胺残留量，每次取3个果实，3次重复。

1.9 检测500 μg/mL咪鲜胺浸果1 min处理后对果实内在品质的影响

500 μg/mL咪鲜胺药液浸果1 min后自然晾干，以清水浸泡果实作为对照，28℃贮藏，分别在4、8、12、16、20天取样，进行果实品质指标测定。可溶性固形物含量用手持折光仪测定，可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法，维生素C含量测定采用2,6-二氯靛酚法，总酸度测定采用酸碱中和滴定法[16]，每处理取3个果实，3次重复。

1.10 病害分级调查标准、数据计算及统计

1.10.1 菠萝果实黑腐病分级调查标准 0级，果实无黑腐病斑；1级，有黑腐病斑，0%＜黑腐病腐烂面积≤10%；2级，10%＜黑腐病腐烂面积≤30%；3级，30%＜黑腐病腐烂面积≤50%；4级，50%＜黑腐病腐烂面积≤70%；5级，70%＜黑腐病腐烂面积。

1.10.2 数据统计与分析 用Excel 2007对实验数据进行整理和绘图，统计用DPS软件，采用邓肯氏新复极差多重比较法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 7种杀菌剂对菠萝黑腐病菌的生物活性影响

由表1可知，7种杀菌剂对病菌菌丝生长均有抑制作用，其中咪鲜胺对菌丝生长抑制作用最强，EC50为0.01 μg/mL；苯醚甲环唑、戊唑醇的抑菌作用次之，EC50分别为0.03、0.05 μg/mL，代森锰锌、百菌清的抑菌效果较差，EC50分别为 34.61、34.41 μg/mL。因此，选择研究咪鲜胺对黑腐病菌生长发育的抑制作用。

表1 杀菌剂对菠萝黑腐病菌的生物活性影响

2.2 咪鲜胺对菠萝黑腐病菌生长发育的影响

用0.005、0.05 μg/mL的咪鲜胺处理病原菌，以加无菌水为对照。培养4 h，对照及2个处理的孢子均开始萌发。培养8 h，芽管延长，统计孢子萌发情况，对照及0.005、0.05 μg/mL咪鲜胺处理的孢子萌发率分别为91.67%、84.50%、74.33%，差异显著。12 h时，对照芽管伸长为菌丝；0.005 μg/mL咪鲜胺处理芽管伸长，但长度明显小于对照；0.05 μg/mL咪鲜胺处理芽管未伸长（图1）。培养16 h和20 h时，对照菌丝迅速伸长，交织成网状；0.005 μg/mL咪鲜胺处理的芽管伸长成菌丝，交织成网状，但菌丝量明显低于对照；0.05 μg/mL咪鲜胺处理的芽管未形成菌丝。24 h时，对照菌丝致密，产生大量孢子；0.005 μg/mL咪鲜胺处理菌丝交织成疏松网状，未见孢子产生；0.05 μg/mL咪鲜胺处理仍未形成菌丝。结果表明，0.005 μg/mL咪鲜胺可抑制菌丝生长和孢子形成；当浓度增加到0.05 μg/mL时，可抑制芽管分化形成菌丝，从而严重抑制病菌的生长发育过程。

图1 咪鲜胺对菠萝黑腐病菌生长发育的影响

2.3 不同浓度咪鲜胺对菠萝黑腐病的防治效果

采用不同浓度咪鲜胺药剂浸果5 min，实验结果见图2，对照组果实发病率为53.33%，病情指数为38.25%。不同浓度咪鲜胺药剂对病害均有防治效果，果实发病率和病情指数随咪鲜胺浓度的增加而下降。咪鲜胺浓度增加到500、1000 μg/mL时，果实发病率分别为20.04%、17.43%，病情指数为8.94%、7.85%，病害防治效果较好，分别为76.62%、79.47%，两者防治效果差异不显著。因此，选择低浓度500 μg/mL作为菠萝黑腐病的防治浓度。

图2 不同浓度咪鲜胺药剂对菠萝黑腐病的防治效果

2.4 500 μg/mL咪鲜胺不同浸果时间对菠萝黑腐病的防治效果

由图3可见，对照菠萝果实发病率为51.25%，病情指数为35.17%。不同浸果时间的黑腐病发病率和病情指数均明显下降，浸泡1、2、3、4、5 min，对黑腐病的防治效果分别为76.51%、71.33%、75.80%、73.78%、77.19%，防治效果差异不显著。因此选用较短时间1 min作为防治菠萝黑腐病的浸果时间。

图3 500 μg/mL咪鲜胺不同浸果时间对菠萝黑腐病的防治效果

2.5 500 μg/mL咪鲜胺浸果1 min对菠萝黑腐病的防治效果

贮藏8、12、16天，咪鲜胺对黑腐病的防治效果均达70%～75%，防治效果稳定（表2）。贮藏20天，防治效果为67.44%。贮藏24天，对照组部分菠萝果实完全腐烂，实验数据不能真实反映咪鲜胺对黑腐病的防治效果，停止调查。处理组24天的果实发病率和病情指数与对照组12天的果实相当，表明500 μg/mL咪鲜胺浸泡菠萝果实1 min，可持续有效防治菠萝黑腐病，大幅度延长菠萝果实货架期。

表2 500 μg/mL咪鲜胺浸果1 min对菠萝黑腐病的防治效果%

2.6 500 μg/mL咪鲜胺浸果1 min处理后在菠萝果实中的残留

咪鲜胺残留结果见表3，500 μg/mL咪鲜胺浸果1 min处理后，2 h取样分析咪鲜胺原始沉积量，全果为2.142 mg/kg，果肉<0.01 mg/kg，表明咪鲜胺药剂浸果后，残留主要集中于菠萝果皮上，果肉中残留极低。处理后1、2、3、4、5天的咪鲜胺残留均低于 GB 2763—2019规定的咪鲜胺在皮不可食热带和亚热带水果的7 mg/kg最高残留限量(MRL)。表明用500 μg/mL咪鲜胺浸泡菠萝果实1 min后，不影响菠萝产品安全。

表3 500 μg/mL咪鲜胺浸果1 min后在菠萝果实中的残留检测结果 mg/kg

2.7 500 μg/mL咪鲜胺浸果1 min处理对果实内在品质的影响

500 μg/mL咪鲜胺浸果1 min后，28℃贮藏4、8、12、16、20天，取样检测咪鲜胺对菠萝果实内在品质指标，结果见图4。与清水处理的对照相比，处理组可溶性固形物、总糖、总酸均差异不显著，但维生素C的含量在处理后8～20天均明显高于清水对照组。表明咪鲜胺处理可延缓菠萝果实采后衰老过程中维生素C含量的降低，保持菠萝内在品质。

图4 500 μg/mL咪鲜胺浸果1 min后对菠萝内在品质的影响

3 结论

咪鲜胺对菠萝黑腐病菌有较强的抑杀作用，对菌丝的EC50为0.01 μg/mL。咪鲜胺主要通过抑制芽管分化形成菌丝，从而严重抑制病菌的整个生长发育过程。用500 μg/mL咪鲜胺浸果1 min，28℃贮藏8、12、16天时，对黑腐病的防治效果可达70%～75%，防控效果稳定，大幅度延长菠萝货架期，且可延缓菠萝果实采后衰老过程中维生素C含量的降低，保持菠萝内在品质，处理后咪鲜胺残留均低于GB 2763—2019规定的咪鲜胺在皮不可食热带和亚热带水果的7 mg/kg最高残留限量(MRL)，不影响菠萝产品安全。

4 讨论

实验发现，‘卡因’菠萝对黑腐病菌较敏感，果实在28℃贮藏16天，黑腐病发病率在50%以上，严重的可达70%以上。常见栽培品种‘巴厘’在28℃贮藏16天，黑腐病发病率在35%以上，严重的可达50%以上，损失较大。因此，筛选高效、低毒、低残留防治药剂成为当务之急。生物测定表明，咪鲜胺对病菌菌丝生长的抑制作用较强，EC50为0.01 μg/mL；苯醚甲环唑和戊唑醇的抑菌作用次之，EC50分别为0.03、0.05 μg/mL，研究结果与谷会等[6]的报道基本一致。而常用于黑腐病防治的广谱杀菌剂代森锰锌和百菌清的抑菌效果较差，EC50分别为34.61、34.41 μg/mL，因此，菠萝黑腐病防治药剂的更新换代势在必行。咪鲜胺可抑制病菌孢子萌发，0、0.005、0.05 μg/mL咪鲜胺处理的病菌孢子萌发率分别为91.67%、84.50%、74.33%，差异显著。但咪鲜胺对病菌菌丝生长的抑制作用更加明显，0.05 μg/mL咪鲜胺处理后，孢子可萌发形成芽管，但芽管不能正常分化形成菌丝，从而严重抑制病菌的整个生长发育过程。

500 μg/mL咪鲜胺浸果1 min后，28℃室温贮藏12、16、20天时，对菠萝黑腐病的防治效果均在70%～75%之间，防治效果稳定，有效延长了菠萝货架期。500 μg/mL是在咪鲜胺防治柑橘、香蕉、芒果等作物贮藏期病害所使用浓度范围之内，只需1次浸果即可有效防治黑腐病。咪鲜胺是英国Boots公司1977年合成的广谱高效咪唑类杀菌剂，通过抑制麦角幽醇的生物合成，破坏菌体细胞膜功能而起作用[17]，广泛用于防治尾孢属、核腔菌属、喙孢属、核盘菌属、镰孢属及白粉菌、炭疽菌等多种作物子囊菌和半知菌病害，有显著的治疗和铲除作用[17-18]。查询中国农药信息网，咪鲜胺已登记在柑橘、香蕉、芒果等水果上，用于果实采后病害防治及保鲜，在红毛丹[19]、火龙果[20]、番石榴[21]、荔枝[22]、石榴[23]等水果上也有相关研究，但尚未有在菠萝上使用的研究报道。GB 2763—2016未规定菠萝的最高残留限量标准，但规定咪鲜胺在皮不可食热带和亚热带水果上7 mg/kg最高残留限量标准，本研究的残留检测表明500 μg/mL咪鲜胺浸果1 min后，2 h取样的原始咪鲜胺沉积量为2.142 mg/kg，低于7 mg/kg。郑雪虹等[24]报道香蕉贮藏采用浓度450 mg/kg咪鲜胺浸果1 min，且浸果1次，2 h后常温条件下原始沉积量为2.315 mg/kg，低于咪鲜胺在香蕉上的最高残留限量标准5 mg/kg。经咪鲜胺处理的菠萝果实的可溶性固形物、总糖、总酸与对照差异不显著，但维生素C含量明显高于对照。巴良杰等[25]也报道咪鲜胺可有效延缓火龙果采后衰老过程中维生素C含量的降低，能较好地保持果实的营养品质。本实验结果表明，500 μg/mL咪鲜胺浸果1 min后可有效防治菠萝果实采后黑腐病，延缓菠萝采后衰老过程中维生素C含量的降低，保持菠萝果实的品质，且不影响菠萝产品安全。

本研究评价了咪鲜胺对菠萝黑腐病菌的抑杀效果，提出用500 μg/mL咪鲜胺药剂浸果1 min以防治黑腐病，该技术操作简单，成本较低，防病效果明显，在菠萝生产中极具推广应用价值，但咪鲜胺对病害的防治效果还需要在生产上进行验证，因此下一步工作将通过田间应用验证咪鲜胺对菠萝黑腐病的防治效果，并进行示范推广。