低温胁迫对军曹鱼幼鱼脂代谢相关基因表达的影响

2021-12-13蔡润佳张静黄建盛施钢潘传豪谢瑞涛陈刚张健东王忠良汤保贵

海洋学报 2021年11期

蔡润佳，张静，黄建盛，施钢，潘传豪，谢瑞涛，陈刚，张健东，王忠良，汤保贵,3*

( 1. 广东海洋大学水产学院，广东湛江 524088；2. 南方海洋科学与工程广东省实验室(湛江)，广东湛江 524025；3. 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东湛江 524088)

1 引言

水温是鱼类最重要的环境因子之一，对鱼类的分布、生存具有决定作用，而当水温低于适宜温度范围时，会深刻影响着鱼类的免疫[1]、发育[2]、生长[3]等各种生命活动。目前的研究[4-6]表明，鱼类脂代谢活动也受到低温的影响，低温胁迫会导致鱼体脂代谢相关指标产生变化。目前关于低温胁迫对鱼类脂代谢相关基因的研究在多个物种上已有报道，如低温胁迫会降低斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)肝脏cpt-1、scd-1和fabp10 的相对表达量[7]；方玲玲[8]研究发现，低水温对卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)肌肉pparα和cpt-1基因的表达具有诱导作用；Mininni等[9]对低温胁迫下的金头鲷（Sparus aurata）应用转录组测序发现，肝脏中大量脂代谢相关基因参与了对低温的响应。可见低温胁迫对鱼类脂代谢相关基因的表达具有较大的影响，也暗示脂代谢调节可能是鱼类应对低温胁迫的重要途径。

鱼类脂肪合成代谢中，乙酰辅酶A作为底物经过乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA Carboxylase, ACC)的催化后产生丙二酰辅酶A，丙二酰辅酶A被脂肪酸合成酶(Fatty Scid Synthase, FAS)多次催化后产生饱和脂肪酸，鱼体可以此为原料进一步合成机体所需的各种脂肪酸[10]。脂肪分解代谢主要包括甘油三酯的水解和细胞内β-氧化等步骤，甘油三酯水解是指甘油三酯被脂肪激素敏感脂肪酶(Hormone Sensitive Lipase,HSL)、单酰基甘油酯酶(Monoacylglycerol Lipase, MGL)等催化生成甘油二酯、甘油一酯和游离脂肪酸的过程[11-13]。胞内β-氧化主要发生在线粒体上[14]，借助脂酰肉碱转移系统中的酶催化长链脂酰CoA，而肉碱脂酰基转移酶-1(Carnitinepalmitoyl Transferase-1, CPT-1)对线粒体β-氧化的速度起着决定作用[10]。

军曹鱼(Rachycentron canadum)属于暖水性鱼类，适宜温度范围为21～31℃，在两广海域养殖常遭受寒潮等极端天气下的低温胁迫。温度会影响军曹鱼的生长、抗氧化酶活性等[15-16]，但未见与脂代谢关系方面的研究。鱼类的脂肪主要储存在肝脏、肌肉、腹腔和皮下组织等4个部位[17]，在军曹鱼中则主要分布在肝脏、肌肉和腹腔。本研究采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法对比分析军曹鱼幼鱼脂代谢相关基因在不同温度（低温和常温）、时间（第1天、第4天、第7天）及组织（肌肉、肝脏和腹腔脂肪）的表达变化情况，为进一步分析军曹鱼脂代谢的分子机制提供参考。

2 材料和方法

2.1 实验动物与管理

将90尾军曹鱼幼鱼[体重（211.17±9.51）g]平均放养在6个300 L的养殖桶中，每天饱食投喂两次(08:00和16:00)，暂养5 d后开始正式实验。常温对照组水温为（30.5±1.0）℃，低温实验组采用密封瓶装冰块按照0.5℃/h匀速降温至（20.0±0.5）℃，实验期间静水养殖且每天更换50%等温新鲜海水。预实验过程中发现军曹鱼幼鱼在20℃时完全无食欲，为避免残余饲料污染水质，故低温组不投喂，对照组保持每天两次正常喂食。实验组和对照组均不间断充气，维持溶氧在5 mg/L、pH为7.4～7.8；每隔30 min检测1次水温，每天使用水质检测试剂盒监测水质，维持对照组和低温组除温度外的水环境因子一致且保持有害物质浓度处于较低水平（氨氮小于0.02 mg/L、亚硝酸盐小于0.01 mg/L）。

2.2 样品采集

预试验结果显示，军曹鱼在20℃的低温条件下半致死时间为7 d，所以正式实验时长设置为7 d。在第1天、第4天、第7天时分别采集低温胁迫组和常温对照组样品，将每桶3尾鱼的组织样品混合成一管，以同个水温中3个桶的样品作为3个生物学重复进行检测。采用丁香酚麻醉后取肌肉、肝脏和腹腔脂肪放入液氮速冻，再转移至−80℃冰箱中保存待测。

2.3 总RNA提取与反转录

将样品放置于装有少量液氮的研钵中研碎至粉末状，然后按照RNA提取试剂盒(TransZOL Up Plus RNA Kit，北京全式金生物技术有限公司)说明书进行总RNA的提取，提取后采用1%琼脂糖凝胶电泳检验提取的RNA条带以及使用超微量核酸蛋白检测仪对RNA的纯度和浓度进行检测。取1 μL总RNA为反转录的模板按照反转录试剂盒(EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix，北京全式金生物技术有限公司)说明书合成第一链cDNA。

2.4 引物设计

从军曹鱼已有转录组数据(未发表)中查找各个目标基因及内参基因β-actin基因序列，使用Primer 5.0软件设计各个基因的上、下游引物序列，引物由上海生工生物股份有限公司合成。引物经过验证确保特异性、PCR结果无二聚体和非特异性扩增后作为正式实验引物。本实验所用引物序列如表1所示，其中acc、fas、hsl、cpt-1和mgl为目标基因，β-actin为内参基因。

表1 本实验引物序列Table 1 The primers used in the experiment

2.5 基因表达量检测

采用荧光定量试剂盒(PerfectStart Green qPCR SuperMix，北京全式金生物技术有限公司)对肝脏、肌肉和腹腔脂肪等组织进行检测，将5个基因测得的Ct值按照2−ΔΔCt法[18]计算相对表达量。10 μL反应体系包括ddH2O 3.5 μL、上下游引物各0.5 μL、cDNA(100 ng/μL)0.5 μL、SYBR Green Supermix 5 μL。PCR扩增程序为：94℃预变性30 s；94℃变性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸10 s，循环40次；72℃延伸5 min。分析溶解曲线确保扩增结果为单PCR产物。每个样本重复3次。

2.6 统计分析

实验数据采用平均值±标准差(Mean±SD)表示，采用SPSS 19.0软件的T检验对相同时间点的对照组和低温组数据进行差异分析。分析结果默认当p<0.05时为差异显著，p<0.01时为差异极显著。

3 结果

3.1 低温胁迫下军曹鱼脂分解相关基因表达

军曹鱼幼鱼在低温胁迫第1天、第4天和第7天时，肝脏cpt-1表达量均极显著高于对照组(p<0.01)，肝脏hsl表达量在低温胁迫第1天和第4天时极显著高于对照组(p<0.01)，第7天时表达量下降但仍显著高于对照组(p<0.05)，肝脏mgl表达量在第1天时与对照组无显著差异(p>0.05)，第4天和第7天时均极显著高于对照组(p<0.01) (图1a)。随着低温胁迫时间的延长，军曹鱼肌肉cpt-1表达量呈现先升后降的趋势，其中第1天时极显著高于对照组(p<0.01)，第4天时下降至与对照组无显著差异(p＞0.05)，第7天时表达量下降至极显著低于对照组(p<0.01)，肌肉hsl表达量在低温胁迫第1天、第4天和第7天时均极显著高于对照组(p<0.01)，肌肉mgl表达量在胁迫过程中逐渐上升，第1天时显著高于对照组(p<0.05)，第4天和第7天均极显著高于对照组(p<0.01)(图1b)。腹腔脂肪cpt-1表达量在低温胁迫第1天时极显著低于对照组(p<0.01)，第4天时升高至显著高于对照组(p<0.05)，第7天时表达量约为对照组的6倍，并达到差异极显著水平(p<0.01)，腹腔脂肪hsl表达量和mgl表达量变化趋势完全一致，两个基因均在第1天时极显著降低了表达(p<0.01)，在第4天和第7天时升高至极显著高于对照组(p<0.01)(图1c)。

图1 低温胁迫下军曹鱼幼鱼3个脂分解相关基因表达量Fig. 1 Expression of three lipolysis-related genes in juvenile cobia under low temperature stress*表示低温组与同期对照组之间差异显著(p<0.05)；**表示差异极显著(p<0.01)*indicates a significant difference (p<0.05); **indicates extremely significant difference (p<0.01) compared with the control group in the same period

3.2 低温胁迫下军曹鱼脂合成相关基因表达

军曹鱼幼鱼在低温第1天和第4天时极显著降低了肝脏acc表达量(p<0.01)，而胁迫至第7天时肝脏acc表达量则显著高于对照组(p<0.05)，呈现出先下降后上升的趋势。肝脏fas表达量在低温胁迫的第1天、第4天和第7天时均极显著低于同期对照组(p<0.01)，仅约为对照组表达量的0.2倍(图2a)。军曹鱼幼鱼肌肉acc表达量在低温胁迫过程中呈现出先降后升的趋势，在第1天时显著低于对照组(p<0.05)，第4天和第7天时均极显著高于对照组表达量(p<0.01)，肌肉fas表达量随着低温胁迫的进行表现为先降后升再降的趋势，第1天时极显著低于对照组(p<0.01)，在第4天时表达量达到最高且极显著高于对照组(p<0.01)，第7天时又下降至与对照组无显著差异(p＞0.05)(图2b)。腹腔脂肪中，军曹鱼腹腔脂肪组织acc表达量随着低温胁迫的进行呈现先降后升趋势，其中第1天时极显著低于对照组(p<0.01)，第4天时显著高于对照组(p<0.05)，第7天时表达量进一步提高，与对照组达到差异极显著水平(p<0.01)，腹腔脂肪组织fas表达量在低温胁迫第1天时极显著降低(p<0.01)，但在第4天和第7天时升高至与对照组无显著差异(p＞0.05)(图2c)。

图2 低温胁迫下军曹鱼幼鱼3个脂合成相关基因表达量Fig. 2 Expression of three lipid synthesis-related genes in juvenile cobia under low temperature stress*表示低温组与同期对照组之间差异显著(p<0.05)；**表示差异极显著(p<0.01)*indicates a significant difference (p<0.05) ; **indicates extremely significant difference (p<0.01) compared with the control group in the same period

4 讨论

4.1 低温胁迫对军曹鱼幼鱼脂分解代谢的影响

鱼类吸收脂肪酸后以甘油三酯的形式进行储存，并在机体需要的时候通过甘油三酯水解和脂肪酸胞内氧化来产生能量。研究表明，甘油三酯代谢过程受到水环境温度的影响。Wen等[19]研究发现，低温虽然导致了七彩神仙鱼(Symphysodon aequifasciatus)的代谢率下降，但是七彩神仙鱼可以通过自主调节来维持内环境稳态，提高甘油脂代谢就是其中的途径之一。在鲤[20]、金头鲷[21]、斑马鱼(Danio rerio)[22]等物种上也发现低温胁迫对鱼体脂代谢具有促进作用。在本研究中，军曹鱼幼鱼腹腔脂肪组织在低温胁迫第1天时降低了hsl基因和mgl基因的表达，在第4天和第7天时又显著上调了这两个基因的表达量。由此推测军曹鱼在低温胁迫后期才开始释放储存在腹腔脂肪的脂质。在肝脏组织中，hsl表达量先升高后逐渐降低，mgl表达量在低温第1天时与对照组无显著差异，在低温胁迫后期才有显著提高，结果暗示，军曹鱼肝脏在低温胁迫过程中首先通过提高对甘油三酯的催化效率来满足机体对脂肪酸的需要，在胁迫后期还会通过增强催化分解甘油一酯来进一步补充机体的游离脂肪酸含量。在肌肉组织中，军曹鱼在低温过程中均显著提高了hsl基因和mgl基因的表达，推测促进脂肪水解代谢是维持肌肉能量供应的重要途径之一。

游离脂肪酸从甘油三酯中释放出来之后，还需要经过β-氧化才能释放出能量，此过程主要受到cpt-1活力的影响。本研究发现，在低温胁迫前期，肝脏和肌肉cpt-1表达量均显著升高，与卵形鲳鲹[8]、斜带石斑鱼[7]、多鳞白甲鱼(Onychostoma macrolepis)[23]等物种的研究结果一致，可见提高脂肪酸β-氧化可能是多种鱼类应对低温胁迫的共有反应。但随着低温胁迫时间的延长，cpt-1表达量在军曹鱼3种组织中出现了差异，在肝脏中的表达量与胁迫前期一致仍显著高于对照组，但在肌肉中表达量逐渐下降，腹腔脂肪中的表达量则逐渐升高。由cpt-1基因在3个组织的表达情况推测，军曹鱼在低温胁迫前期进行脂肪酸β-氧化的主要组织是肝脏和肌肉，而在胁迫后期进行脂肪酸β-氧化的主要组织则变成是肝脏和腹腔脂肪。

4.2 低温胁迫对军曹鱼幼鱼脂合成代谢的影响

动物体在正常情况下，体内的脂质主要来自食物摄入和体内生物合成等两个途径[24]，食物摄入减少或停止会导致脂质代谢的平衡受到破坏，此时提高脂质生物合成相关基因表达，可使机体的脂质代谢恢复到一个新的平衡。ACC和FAS是影响脂肪生物合成的两个关键限速酶[25-26]。通过对军曹鱼肌肉、肝脏和腹腔脂肪的检测分析发现，除了肝脏fas的表达水平在低温时均极显著低于对照组之外，acc表达量在3种组织以及fas在肌肉和腹腔脂肪中的变化趋势都表现为先下降后上升。推测低温胁迫第1天时，由于机体代谢强度随着温度的下降而下降，所以出现了脂质合成基因表达量减少的情况。但随着军曹鱼在低水温环境中进行适应性调整，脂质合成相关基因表达量有所提升。乙酰辅酶A被ACC催化后产生的丙二酰辅酶A是脂质代谢的关键调控因子，可以决定脂肪酸是氧化供能还是进行酯化反应[10]，并且能够抑制肉碱转移酶的活性从而减少脂肪酸的氧化[27]，增加脂肪在细胞内的沉积[28]。军曹鱼肝脏fas表达水平的降低可能导致丙二酰辅酶A的蓄积，从这方面看，低温条件下，军曹鱼可能通过丙二酰辅酶A来调节体内脂肪酸氧化过程，以延长脂肪酸供能的时间。另外，fas表达量在肝脏和腹腔脂肪中呈现出下降或与对照组无显著差异的趋势，仅在低温胁迫第4天时的肌肉组织中极显著升高，表明肝脏和腹腔组织在低温胁迫过程中，与对照组脂肪酸生物合成量相比没有升高甚至有所下降。在胁迫中期，肌肉中脂肪酸合成基因的表达显著增加，说明低温胁迫对军曹鱼脂肪酸在不同组织间的分布产生一定影响。本实验中，发现军曹鱼肌肉在低温前期中显著上调了脂分解相关基因的表达，而增加肌肉在低温胁迫中期脂质合成相关基因的表达可以补偿前期过多的消耗，从而维持肌肉中脂肪酸含量的相对稳定。肝脏同样作为低温前期的主要供能组织，fas表达量却在整个低温过程中极显著降低，推测组织脂肪含量以及组织功能可能是肝脏与肌肉fas差异表达的重要因素，具体原因则有待进一步分析。