鱼腥草挥发油对膝关节骨性关节炎大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平的影响

秦 萍，李章春，刘 燕，谢洪书

(黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558000)

膝关节骨性关节炎(KOA)是临床骨科较为常见的一种非细菌性、非对称性的慢性退行性疾病，主要特征为关节软骨的退化和退变，临床表现多为膝关节肿胀、疼痛、活动受限、功能障碍、畸形等[1]。研究显示，KOA的全球发病率约为12%，我国患病率为5.4%～30.5%[2]。中老年是该疾病的高发群体，严重影响患者日常生活及生命质量。尽管KOA的具体发病机制还不十分明确，但相关研究认为，IL-1β、IL-6等炎症因子在其早、中期的发生与发展过程中具有关键作用[3]。现代医学常用的抗炎镇痛药物主要是糖皮质激素、臭氧等药物，然而由于此类药物易对肠胃产生严重的不良反应，所以治疗效果并不理想[4]。中医药具有价格低廉、副作用小、止痛快等特点，在KOA的早、中期治疗过程中具有独特优势[5]。鱼腥草挥发油是鱼腥草的主要成分，具有抗炎、抗病毒等作用[6]，目前已进行多项疾病的基础医学研究，但有关KOA的相关研究未见报道。通过观察鱼腥草挥发油对KOA大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平的影响，进一步探讨鱼腥草挥发油的抗炎作用及机制，为临床治疗提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物分组与药物

60只健康SD大鼠，雌雄各半，体重200～220 g，单位：长沙市天勤生物技术有限公司提供，许可证号SCXK[湘]2019-0013。随机分为假手术组(正常对照组)、模型组(KOA模型对照组)、阳性药物组(阳性药物对照组)、鱼腥草挥发油高中低剂量组，每组10只，分笼饲养，适应性饲养3 d。盐酸氨基葡萄糖片(国药准字H20060647，江苏正大清江制药有限公司生产)。

1.1.2 试剂与仪器

IL-1β、IL-6和TNF-α检测试剂(武汉纯度生物科技有限公司生产)、注射用青霉素钠(国药准字H13020431，华北制药股份有限公司生产)、全自动酶标仪(mindrady MR-96A)。

1.2 方法

1.2.1 模型制备

依据文献[7]，假手术组大鼠在切口皮肤打开关节腔后，仅进行生理盐水冲洗，进行缝合，不破坏半月板、韧带等组织。其余组大鼠采用改良Hulth法进行造模：将大鼠用乙醚麻醉，仰卧位固定在操作台上，取右侧膝关节进行模型制备，常规备皮和消毒，无菌条件下于髌骨旁内侧行2 cm左右切口，逐层打开皮肤、筋膜，暴露关节腔，屈曲膝关节，依次剪断前交叉和内侧副韧带，摘除内侧半月板。术中保护好其他周围组织，切勿伤及关节软骨面。用生理盐水对关节腔进行清洗2～3次，逐层进行缝合。术后每组大鼠进行肌肉注射青霉素，剂量40万U/d，连续注射7 d。第8 d开始每天驱赶大鼠活动，2次/d，每次30 min左右，连续驱赶4周，4周后开始给药治疗。

1.2.2 药物提取与给药

依据文献[8-9]方法进行鱼腥草挥发油的提取。将100 g干鱼腥草粉碎，以1∶10的比例将料液与入蒸馏水进行充分混合，常温下在旋转蒸发仪中浸泡10 h，70℃加热回流10 h，停止加热，收集挥发油。以吐温-80为乳化剂，溶于生理盐水，配制成0.5%吐温-80的挥发油制备液，储存备用。给药方法[10]：阳性药物组给予盐酸氨基葡萄糖水溶液灌胃治疗(剂量0.26 g/kg)；鱼腥草挥发油高、中、低剂量组分别以100 mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg挥发油制备液进行灌胃治疗；模型组和假手术组给予同阳性药物组相同剂量的蒸馏水灌胃，连续给药6 w，1次/d。

1.2.3 实验取材

于末次给药后的次日称取大鼠质量，股动脉取血处死大鼠，经静置、离心，取上清液备用。截取大鼠膝关节及滑膜组织置于4%的多聚甲醛固定，取肾脏、肝脏、脾脏等组织，计算脏器指数。

1.2.4 标本处理

取经多聚甲醛固定的大鼠膝关节组织，经常规组织脱水、包埋、脱蜡等处理，进行HE染色，光镜下观察组织病理学改变。

1.2.5 IL-1β、IL-6和TNF-α检测

ELISA法检测各组大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平，严格遵循说明书进行操作。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 不同组别大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平比较

与正常组比较，模型组和各药物治疗组大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均显著升高(P<0.05)；与模型组比较，各药物治疗IL-1β、IL-6和TNF-α水平均有不同程度的降低，其中阳性药物组和高剂量组炎症因子水平降低最为明显，两组间IL-1β、IL-6和TNF-α水平比较差异不具有统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 不同组别大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平比较

2.2 不同组别大鼠膝关节组织病理学观察比较

组织病理学检测结果显示，正常组大鼠膝关节滑膜未见异常改变(图1)；模型组大鼠膝关节滑膜组织内可见纤维组织明显增生及大量炎症细胞浸润(图2)；与模型组相比，各治疗组大鼠膝关节滑膜组织炎症病理学改变均有不同程度减轻，其中高剂量组间质轻度纤维化，慢性炎症细胞浸润现象明显好转，与阳性对照组病变缓解程度相近(图3～6)。

图1 正常组大鼠膝关节滑膜组织切片(HE×400)Fig.1 Tissue sections of synovium of knee joint in normal group(HE×400)

图2 模型组大鼠膝关节滑膜组织切片(HE×400)Fig.2 Tissue sections of synovium of knee joint in model group(HE×400)

图3 阳性药物组大鼠膝关节滑膜组织切片(HE×400)Fig.3 Tissue sections of synovium of knee joint in positive medicine group(HE×400)

图4 高剂量组大鼠膝关节滑膜组织切片(HE×400)Fig.4 Tissue sections of synovium of knee joint in high dosage group(HE×400)

图5 中剂量组大鼠膝关节滑膜组织切片(HE×400)Fig.5 Tissue sections of synovium of knee joint in medium dosage group(HE×400)

图6 低剂量组大鼠膝关节滑膜组织切片(HE×400)Fig.6 Tissue sections of synovium of knee joint in low dosage group(HE×400)

3 讨论

KOA的病变通常是从膝关节软骨退行性改变开始，此后逐渐累及滑膜、关节腔等组织结构。有关发病机制研究发现，细胞因子、遗传学、自身免疫等因素在其发生与发展过程中具有重要作用。研究发现[11-12]，KOA病变的一个重要原因是软骨细胞异常分化，引起TNF-α、IL-1β、IL-6等分解代谢因子分泌加剧，这些炎症因子与滑膜、关节软骨的破坏关系十分密切。颜春鲁[7]等对KOA大鼠炎性因子表达研究发现，IL-1β、IL-6和TNF-α在KOA大鼠血清内为高表达；金剑飞等[13]对KOA大鼠NF-κB信号通路进行研究发现，通过抑制NF-κB通路能够下调IL-1β、IL-6和TNF-α炎症因子水平，对KOA大鼠炎症起到缓解作用。在本研究中，与正常组比较，模型组和各药物治疗大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均显著升高(P<0.05)，表明模型制备导致KOA大鼠炎症因子水平升高，该研究结果与此前相关研究结果较为一致。6 w给药治疗结束后，与模型组比较，各药物治疗组大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均不同程度降低，其中阳性药物组和鱼腥草挥发油高剂量组下降最为明显，且两组间比较差异不具有统计学意义(P>0.05)，表明鱼腥草挥发油能够对KOA大鼠炎症因子发挥抑制作用。

鱼腥草属三白草科蕺菜属植物蕺菜的全草或地上部分，性微寒、味辛，具有消痈排脓、清热解毒、利尿除湿的功效。鱼腥草挥发油是其主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、清除自由基等多种生物活性功能[14]。李少金等[8]通过对鱼腥草挥发油对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用进行研究，结果发现，鱼腥草挥发油能够降低大鼠IL-6和TNF-α水平，对心肌缺血再灌注大鼠损伤发挥保护作用。黄定根等[15]通过鱼腥草挥发油对去卵巢小鼠骨质疏松的预防作用进行研究，结果表明，鱼腥草挥发油能够通过降低小鼠血清IL-1β和TNF-α水平，对去卵巢小鼠骨质疏松发挥保护作用。在本研究中，与模型组比较，阳性药物组和鱼腥草挥发油高剂量KOA大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平下降最为明显，病理观察显示，高剂量组间质轻度纤维化，慢性炎症细胞浸润现象明显好转，与阳性对照组病变缓解程度相近，表明鱼腥草挥发油对KOA大鼠膝关节滑膜组织具有保护作用，且呈剂量依赖性。

综上所述，研究认为鱼腥草挥发油能够缓解KOA大鼠的炎症，其作用机制可能与抑制炎症因子表达有关，因鱼腥草挥发油的应用研究尚处探索阶段，其确切作用机制还需进一步深入研究。