溶菌酶对热应激肉鸡肠道炎症和氧化应激的影响

2021-12-10王金龙张大伟张宗国高媛媛孙同毅

饲料工业 2021年22期

■梅迪王金龙张大伟张宗国高媛媛孙同毅王政*

（1.潍坊医学院生命科学与技术学院，山东省蛋白质与多肽药物工程实验室，山东潍坊 261053；2.青岛根源生物技术集团有限公司，国家企业技术中心，山东青岛 266000；3.潍坊医学院药学院，山东潍坊 261053）

热应激是影响肉鸡生产的一个重要因素，研究表明，当饲养环境为30～35℃时，肉鸡的摄食量会减少，影响肉鸡的肉品质和生长速度[1]，当肉鸡处于热应激状态时，有少部分的肠腔内毒素、共生菌和致病菌可以穿过上皮紧密连接进入血液循环，刺激局部肠道上皮细胞，影响肉鸡的正常生长[2]。因此，在高温的饲养条件下对肉鸡进行抗菌干预十分必要。传统抗生素滥用导致的耐药菌出现，同时药物残留问题一直限制了抗生素的使用，因此，寻找安全性高、无残留的抗生素替代品显得十分迫切[3]。

溶菌酶是生物体内具有杀菌和免疫调节等功能的非特异性免疫分子。是机体对抗微生物入侵的天然防御分子[4]，研究表明，饲料中添加溶菌酶还能提高肉鸡免疫力以及促进增重等效果[5]，目前溶菌酶添加饲料相关研究尚处于起步阶段，在饲料中添加溶菌酶对肉鸡肠道健康的影响研究较少。本研究旨在研究饲料中添加溶菌酶对肉鸡肠道健康的影响，为溶菌酶在肉鸡饲养中的推广和应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料和试验动物

溶菌酶（2.0×105IU/g）由青岛根源生物技术集团有限公司（中国青岛）提供，肉鸡（ROSS 308）购自当地农场（中国青岛）。RNA提取试剂盒提取（Takara Bio，Shiga，Japan），反转录试剂盒（TaKaRa Bio），血清超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（TAOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）以及丙二醛（MDA）试剂盒购买自上海纪宁生物科技有限公司。

1.2 试验设计

800只1日龄的肉鸡（400只雌性，400只雄性）被随机分成4组（TN、HS、HS-AB和HS-L），每组10个重复，每个重复20只，TN组（热中性组），HS组（热刺激组），HS-AB组（抗生素添加热刺激组），HS-L组（溶菌酶添加热刺激组）。试验动物被饲养在1.5 m×1.5 m的鸡笼中，鸡笼中有新鲜的木屑和稻壳（1∶1），试验动物可以自由获得颗粒饲料和水。第1 d的饲养条件温度为（35±1.1）℃，相对湿度为（65±5）%，随后饲养环境的温度每周降低2.8℃，直到第21 d时达到26.7℃，将26.7℃和（65±5）%的相对湿度定义为TN区域，从21 d开始，TN组的肉鸡饲养环境温度维持在26.7℃，另外3组（HS-AB、HS和HS-L）受到每天8 h 35℃和75%相对湿度的循环热刺激，时间从第22 d持续到试验结束的第42 d。TN组和HS组肉鸡饲喂正常的玉米-豆粕型饲粮，HS-AB组和HS-L组分别喂养添加金霉素（300 g/t）和溶菌酶（625 g/t）的饲料。饲料中的抗生素或溶菌酶在饲料成粒以前加入，本研究使用的饲料不含抗生素或抗球虫药物，标准都满足或超过1994年国家研究委员会的要求，配方饲料如表1所示。在试验的第42 d测定各组肉鸡的生长性能，每组随机选取6只肉鸡屠宰。动物试验处理与使用规程获得青岛农业大学动物伦理与使用委员会批准。

表1 基础日粮组成及营养水平

1.3 样品收集

取出十二指肠和梅克尔憩室之间的空肠样本，用冰生理盐水轻轻冲洗。试验需要的肠黏膜标本，使用无菌玻片轻轻刮拭黏膜表面，分析肠黏膜炎症因子mRNA表达水平的变化。使用冰生理盐水冲洗空肠样本，分析紧密连接mRNA表达水平的变化。将所有肠道样本快速在液氮中冷冻，并保存在-80℃以进一步分析。采集的血液样本，2 000×g，4 ℃、离心20 min，收集血清，保存在-20℃，待进一步分析。

1.4 血清抗氧化状态分析

血清超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）以及丙二醛（MDA）含量使用上海纪宁生物科技有限公司的试剂盒进行检测。

1.5 实时定量PCR

总RNA使用RNA提取试剂盒提取。使用Nano-Drop-1 000超微量分光光度计260/280 nm吸光度比值来检测RNA的浓度和纯度。根据试剂盒厂家提供的试验流程采用7 500 Fast Dx实时荧光定量PCR仪进行实时聚合酶链反应。目的基因和管家基因引物序列如表2所示。总反应体系体积为20 μL，包括2 μL浓度为1 200 ng/μL的cDNA、0.8 μL浓度为10 μmol/L的引物、10 μL的2×SYBR®Premix Ex Taq™ Ⅱ以及6.4 μL无RNA酶水。PCR仪循环条件为95℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，循环44次。

表2 用于PCR反应设计的引物序列

1.6 数据分析

使用SPSS 16.0用于数据分析。在4组间进行方差分析，进行Duncan’s检验确定治疗间的显著性。统计显著性的是基于P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 空肠黏膜炎症因子mRNA水平的变化（见表3）

由表3可知，经热应激处理后，肉鸡空肠黏膜中相关炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS mRNA水平明显提高（P＜0.05）。与热应激组相比，HS-AB组IL-1β、IL-6和iNOS mRNA的表达水平显著降低（P＜0.05），TNF-αmRNA的表达水平显著提高（P＜0.05）；HS-L组IL-1β、IL-6和iNOS mRNA的表达水平显著降低（P＜0.05），TNF-αmRNA的表达水平无明显改变（P＞0.05）。

表3 对空肠黏膜炎症因子mRNA表达水平的影响

2.2 空肠标本紧密连接mRNA表达水平（见表4）

由表4可知，经环境高温处理后，空肠黏膜紧密连接相关蛋白 Claudin-1、Claudin-5、Occludin以及ZO-1 mRNA表达水平显著降低（P＜0.05）。与热应激组相比，HS-AB组Claudin-1、Claudin-5以及ZO-1 mRNA表达水平显著升高（P＜0.05），Occludin mRNA表达水平无显著变化（P＞0.05）；HS-L组Claudin-1、Claudin-5以及ZO-1 mRNA表达水平显著升高（P＜0.05），Occludin mRNA表达水平无显著变化（P＞0.05）。

表4 空肠标本紧密连接mRNA表达水平

2.3 溶菌酶对热应激肉鸡回肠绒毛高度和隐窝深度的影响（见表5）

由表5可知，经环境高温处理后，肉鸡回肠绒毛高度显著变短（P＜0.05），隐窝深度显著变深（P＜0.05），肠绒毛高度/隐窝深度比率显著变小。与热应激组相比，HS-AB组肉鸡回肠绒毛高度显著变高（P＜0.05），隐窝深度显著变浅（P＜0.05），肠绒毛高度/隐窝深度比率显著变大（P＜0.05）；HS-L组肉鸡回肠肠绒毛高度显著变高（P＜0.05），隐窝深度显著显著变浅（P＜0.05），肠绒毛高度/隐窝深度比率显著变大（P＜0.05），基本恢复到正常水平。

表5 溶菌酶对热应激肉鸡回肠绒毛和隐窝深度的影响

2.4 溶菌酶对热应激肉鸡状态抗氧化水平的影响（见表6）

由表6可知，经环境高温处理后，肉鸡血清中MDA水平显著升高（P＜0.05），SOD、GSH-Px和TAOC含量无显著变化（P＞0.05）。与热应激组相比，HS-AB组肉鸡血清中MDA水平显著降低（P＜0.05），GSH-Px和TAOC含量显著升高（P＜0.05）；HS-L组肉鸡血清中MDA水平显著降低（P＜0.05），SOD、GSH-Px和TAOC含量显著升高（P＜0.05）。

表6 溶菌酶对热应激肉鸡血清抗氧化指标的影响

3 讨论

3.1 溶菌酶对热应激肉鸡空肠黏膜炎症因子mRNA表达水平的影响

当动物处于应激状态或肠道发生炎症时，有少部分的肠腔内毒素、共生菌和致病菌可以穿过上皮紧密连接进入血液循环，刺激局部肠道上皮细胞和免疫组织分泌炎症因子。而溶菌酶能够下调致炎因子的表达缓解肠道炎症的发生，效果达到抗生素相似水平[6]。热应激导致肉鸡生产性能下降与炎症因子升高存在着相关关系，肠道炎症因子释放之后，会继发急性期应答反应，肝细胞会转向生成急性期蛋白，肌肉组织分解代谢加强，并且宿主的食欲丧失，从而使动物的生产性能下降[7]。抗生素类生长促进剂的作用机制之一就是可以抑制肠道炎症细胞的分泌并降低致炎因子的表达，同时抑制趋化作用，减少活性氧的产生，因此肉鸡饲料中添加溶菌酶有利于提高动物的生产性能。

3.2 溶菌酶对热应激肉鸡肠紧密连接mRNA表达水平的影响

肠道紧密连接相关蛋白是肠道屏障功能的重要结构基础，在保持肉鸡肠道健康方面发挥了重要的功能。研究表明，肉鸡养殖中许多疾病的发生发展与肠道屏障功能的异常密切相关。Chang等[8]研究发现沙门氏菌感染使肉鸡肠道中Occludin和Claudin基因表达下调。肠道在热应激条件下肉鸡肠道的血流量减少，血液从内脏中分流至皮肤表面加快热量的散失，但这会使肠道缺血，引发ATP耗竭，导致酸中毒并改变离子泵的活性，从而造成肠细胞死亡，并使细胞旁通透性增加[9-10]，同时血流量减少容易导致氧化应激和亚硝化应激，这将使上皮细胞膜和紧密连接的完整性被破坏[11]。添加溶菌酶上调了肠道紧密连接蛋白的mRNA表达水平（Occludin除外），改善了肠道屏障的完整性。

3.3 溶菌酶对热应激肉鸡肠道形态的影响

肠绒毛是小肠黏膜表面上皮和固有层向肠腔内伸出的细小突起，这种肠道形态结构增加了动物机体对营养成分吸收的吸收面积[12]，隐窝深度反映了隐窝细胞的增值率和成熟度，隐窝细胞生长速度变慢会导致肠绒毛萎缩，从而影响肠道对营养物质的吸收效率[11]。高温等应激会引起肉鸡肠道形态变化，尤其是会引起肠黏膜的损伤和绒毛形态的变化，破坏了肠道形态结构（绒毛高度缩小，而隐窝深度升高）。溶菌酶在动物饲料中添加具有良好的应用效果，王坛等[13]在罗非鱼饲料中添加溶菌酶能够提高罗非鱼的生长性能，同时能够促进罗非鱼肠道的发育和健康。Oliver[14]研究表明饲料中添加溶菌酶可以显著增加幼猪空肠绒毛高度。May等[15]研究发现在幼猪饲料中添加溶菌酶可以显著增加幼猪空肠长绒毛高度和隐窝深度，这有利于幼猪对营养物质的吸收。本研究中溶菌酶显著提高了绒毛高度与隐窝深度比值，增强了肉鸡对营养物质吸收的能力。

3.4 溶菌酶对热应激肉鸡抗氧化水平的影响

热应激会诱导动物机体产生大量的活性氧ROS，造成脂质、蛋白质和核酸的氧化损伤[16]。热应激可能使线粒体呼吸链复合物的功能出现缺陷，从而造成线粒体损伤，或者下调家禽解偶联蛋白的表达水平，从而促使动物发生氧化应激[13-14，17]。溶菌酶显著升高了SOD、GSH-Px和TAOC的水平，丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的终产物之一，因此可以作为检测细胞受到氧化损伤严重程度的指标之一[18]。Abdel-Latif等[19]的研究表明肉鸡饲粮中添加外源溶菌酶，特别是在基础饲粮中添加90 g/t溶菌酶时，可改善肉鸡的生长性能、肠道抗氧化状态和非特异性免疫功能。热应激使MDA水平显著升高，而溶菌酶显著降低了MDA水平，避免了肉鸡因高温应激产生氧化损伤。