4种饲料及1种饲料添加剂中拉沙洛西钠的高效液相色谱检测方法优化

■韩鸿飞 程林丽黄家模 陈可心 赵军杰 栾业辉

（中国农业大学动物医学院，北京 100194）

2020年7月我国禁抗计划[1]的实施减少了多种抗生素作为饲料添加剂使用，但同时可能会导致拉沙洛西钠等少数仍被允许使用的抗生素滥用情况严重，在对这些药物进行监测时，检测范围扩大，检测要求更高。目前我国拉沙洛西钠的饲料检测标准为《NY/T 724—2003饲料中拉沙洛西钠的测定高效液相色谱法》[2]。由于该方法建立年代久，在多种饲料和现在的检测限要求下不能满足现阶段对相关样品监控的需要。因此，优化和建立切合目前实际检测需求的分析方法具有重要意义。

拉沙洛西钠（Lasalocid sodium）是一种芳香聚醚类离子载体型抗生素饲料添加剂，具有促生长和抗球虫作用，但是长期及过量使用会对动物产生毒副作用，并造成动物可食性组织中药物残留等问题[3-4]。拉沙洛西钠由5个同系物组成，即拉沙洛菌素钠A、B、C、D和E（图1）。除了美国AOAC官方标准方法测定饲料中5种化合物的总含量[5-8]，我国标准方法和国内外其他相关文献均只检测拉沙洛菌素钠A的含量，将其他4种成分作为杂质看待[2-3]。

图1 拉沙洛西钠分子结构

有关饲料等生物样品中拉沙洛西钠的检测方法报道很多[3]，其中高效液相色谱法为其饲料样品的常用检测方法[9]，其次为液相色谱-串联质谱法[10-11]，此外还有酶联免疫检测方法等[12]。液相色谱-串联质谱法在饲料中拉沙洛西钠的多残留分析中应用很广，该方法采用了二级质谱模式，选择性强，灵敏度高，但是对样品前处理要求很高，需要对样品进行充分净化处理；酶联免疫方法仅作为快速定性分析处理，不适用于定量分析；高效液相色谱法的样品前处理简单、准确度高、选择性好，最适宜用于饲料中该药物的含量分析。本试验为找出操作简单、灵敏度高、准确度高、重复性好，能够满足多种饲料和饲料添加剂样品中拉沙洛西钠的检测方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验仪器

Waters 2695高效液相色谱仪，配Waters2475荧光检测器；ME-T梅特勒-托利多分析天平；XPR梅特勒-托利多微量分析天平；VX200-T涡旋振荡器；Sorvall ST8离心机。

1.2 试验试剂

0.125 mol/L乙酸铵溶液-乙腈（15+85，V/V）；甲醇配制100 μg/mL拉沙洛西钠标准储备液于-18℃下密闭保存，有效期为1年。

标准系列溶液Ⅰ：准确量取适量100 μg/mL标准储备液于10 mL容量瓶中，用甲醇-盐酸（995+5，V/V）分别稀释成0.05、0.1、0.5、1、5 μg/mL标准工作液，临用现配。

标准系列溶液Ⅱ：准确量取适量1 000 μg/mL标准储备液于10 mL容量瓶中，用甲醇-盐酸（995+5，V/V）稀释成0.5、1.0、5.00、10、50 μg/mL标准工作液，临用现配；拉沙洛西钠标准品（CAS：25999-20-6）：纯度≥97%；创腾公司20%拉沙洛西钠预混剂；甲醇、乙腈、三氟乙酸和乙酸铵均为HPLC级；盐酸为36%～38%的分析纯；试验用水为纯水；0.22 μm津腾有机微孔滤膜。

1.3 色谱条件

Athena C18-WP色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温为35℃；流速为1.0 mL/min；进样体积分两种，标准系列Ⅰ及低浓度样品进样25 μL，标准系列Ⅱ及高浓度样品进样2 mL；流动相为乙腈-0.125 mol/L醋酸铵（85+15，V/V）；荧光激发波长为314 nm，发射波长为418 nm。

1.4 样品前处理

称取试样2 g（预混合饲料称取1～2 g，精确到0.001 g）于50 mL离心管中，准确加入20 mL甲醇-盐酸（995+5，V/V），涡动1 min，8 000 r/min离心5 min。取1 mL上清液过0.22 μm有机滤膜后供高效液相色谱分析。

2 结果与讨论

2.1 检测化合物个数的确定（见图2、表1）

拉沙洛西钠由5个同系物组成[4-7]，即拉沙洛菌素钠A、B、C、D和E，其中拉沙洛菌素钠A为主要成分，其他4种同系物含量极少，因此，我国原标准NY/T 724—2003中只检测了拉沙洛菌素钠A[2]。而美国AOAC官方标准方法在当时的条件下分为两种处理方式，低浓度条件时只检测拉沙洛菌素钠A，高浓度条件时计算5种化合物的总量[5-6]。

目前市场上能购得的拉沙洛西钠标准品有拉沙洛西钠和拉沙洛菌素钠A两种。为了判断是否有检测其他4种同系物的必要性，对拉沙洛西钠标准品和拉沙洛菌素钠A标准品以及20%拉沙洛西钠预混剂进行了分析。结果见图2和表1，供试的预混剂中5种成分A成分占99.27%；供试拉沙洛菌素钠标准品中A成分占98.14%；供试拉沙洛菌素钠A标准品中A成分占98.13%。由此可知，拉沙洛西钠的检测中分析A成分是完全合理的，其他4种同系物可以当成杂质处理。

图2 3种拉沙洛西钠色谱图

表1 3种拉沙洛西钠的5个组分检测结果

2.2 流动相的比较研究（见图3）

NY/T 724—2003采用磷酸盐缓冲液-乙腈-甲醇（25+35+40，V/V，pH 7）为流动相，《NY/T 724—2003拉沙洛西钠的测定高效液相色谱法》采用乙腈-125 mmol/L醋酸铵缓冲液（85+15，V/V，pH 4.75）为流动相，由此推断中性或弱酸性条件均适合拉沙洛西钠的检测。而不调pH时醋酸铵溶液的pH为中性7左右，因此，保持其他检测条件不变，对上述两个标准方法的流动相与乙腈-125 mmol/L醋酸铵溶液（85+15，V/V）进行比较，结果如图3所示，在测试的浓度范围内，乙腈-125 mmol/L醋酸铵缓冲液（85+15，V/V，pH 4.75）和乙腈-125 mmol/L醋酸铵溶液（85+15，V/V）的标准曲线区别很小，但磷酸盐缓冲液-乙腈-甲醇（25+35+40，V/V，pH 7）时标准曲线的斜率显著低于前两种流动相，而前两种流动相中，不调节pH值时减少了工作量。因此选择乙腈-125 mmol/L醋酸铵溶液（85+15，V/V）为流动相。

图3 3种缓冲液流动相不同浓度标准曲线

2.3 提取条件的优化（见图4、图5）

NY/T 724—2003采用甲醇为提取溶剂，常温振荡30 min，提取3次[2]。美国AOAC官方标准[5]方法采用甲醇-盐酸（995+5，V/V）为提取溶液，40 ℃超声20 min和40℃振荡60 min，过夜后继续振摇10 min，提取1次进行样品处理[4]。前者提取3次比较繁琐，后者需要过夜处理时间太长。为了简化操作程序，达到简单高效的目的，分别采取上述两种提取液，将提取步骤改成涡动1 min，分别对添加浓度为1 mg/kg和100 mg/kg的4种饲料和1种饲料添加剂样品进行添加回收试验。试验结果如图4和图5。甲醇提取的回收率普遍低于甲醇-盐酸（995+5，V/V），而相对标准偏差却远高于后者，且后者的准确度和精密度完全满足分析方法的要求。因此，本方法确定采用甲醇-盐酸（995+5，V/V），涡动1 min提取样品。

图4 甲醇提取和酸化甲醇提取回收率

图5 甲醇提取和酸化甲醇提取的相对标准偏差

2.4 方法性能检验（见表2、图6）

采用通过上述研究确定的提取和检测条件进行检测。对鸡配合饲料、鸡浓缩饲料、牛精料补充料、猪预混合饲料和贝壳粉进行拉沙洛西钠的空白添加回收试验，鸡配合饲料添加浓度为5、50 mg/kg和100 mg/kg；鸡浓缩饲料和牛精料补充料添加浓度为10、100 mg/kg和200 mg/kg；猪预混合饲料和贝壳粉添加浓度为100、1 000 mg/kg和10 000 mg/kg，每个浓度设4～5个平行，重复3次。结果见表2。5种饲料和1种饲料添加剂的各药物添加水平的平均回收率范围为84.38%～100.33%，批内变异系数为0.86%～5.28%，批间变异系数为2.76%～8.76%。符合方法的准确度和精密度要求。

表2 1 mg/kg 4种饲料和1种饲料添加剂中拉沙洛西钠的添加回收试验结果

对空白饲料样品进行4次样品提取试验，每次5个平行，共计20个空白饲料，分别以3倍和10倍平均信噪比计算各种饲料样品的检测限，结果测得鸡配合饲料、鸡浓缩饲料、猪预混合饲料、牛精料补充料以及贝壳粉中拉沙洛西钠的检测限依次为0.256、0.300、0.299、0.168、0.218 mg/kg；定量限依次为0.853、0.999、0.996、0.559、0.726 mg/kg。对各种饲料进行1 mg/kg的添加回收试验，回收率均大于80%，各饲料样品的空白添加色谱图见图6。由图6可知，在拉沙洛西钠的保留时间位置，各饲料样品均无杂峰干扰。

图6 4种饲料和1种饲料添加剂样品中拉沙洛西钠（1 mg/kg）标准溶液、空白样品、空白添加色谱图

3 讨论

通过对拉沙洛西钠在4种饲料和1种饲料添加剂中检测方法的优化，得到了较为简单、灵敏，准确度高，重复性好，能够满足多种饲料和饲料添加剂样品中拉沙洛西钠的分析要求的检测方法。但同时也存在不足，如含乙酸铵的流动相容易造成色谱柱的残留，需要定期强力冲洗再生。随着色谱仪器在使用中的不断改进，含挥发性盐如乙酸铵的使用逐渐被替换，这是今后要考虑的方向。