利用HPLC-ICP-MS方法测定中华绒螯蟹不同形态砷的残留量

殷玉婷，汪 倩，陈 曦,2，桂 源，宋 超,

（1南京农业大学无锡渔业学院，江苏无锡 214081；2中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，江苏无锡 214081；3农业农村部水产品质量安全环境因子风险评估实验室（无锡），江苏无锡 214081；4农业农村部水产品质量安全控制重点实验室，北京 100141）

0 引言

砷(Arsenic,As)通常以无机和有机的形态存在于自然界中，无机砷毒性很强，被确定为一级致癌物[1]。无机砷主要指砷酸盐[Arsenate,As(Ⅴ)]和亚砷酸盐[Arsenite,As(Ⅲ)]；有机砷毒性相对较弱，主要指一甲基砷酸(Monomethyl arsenic acid,MMA)、二甲基砷酸(Dimethyl arsenic acid, DMA)、砷 甜 菜 碱(Arsenobetaine,AsB)、砷胆碱(Arsenocholine,AsC)、砷糖和砷脂等；而砷胆碱(AsC)、砷甜菜碱(AsB)、砷糖、砷脂则基本上认为无毒[2]。若按照砷化合物以半致死量(LD50)来计算，那么这6种砷形态的毒性大小可分为亚砷酸盐[As(Ⅲ)]>砷酸盐[As(Ⅴ)]>一甲基砷酸(MMA)>二甲基砷酸(DMA)>砷胆碱(AsC)>砷甜菜碱(AsB)[3]。砷广泛存在于土壤、河水、海水以及大气中，砷不会以单质状态存在，在多种物质中都含有砷的存在。砷在海水中含量较少而在淡水中含量较高，分别是2 μg/kg和0.4～80 μg/kg[4]，因海水中含有藻类可以聚集砷而淡水中没有，所以砷会被甲壳类生物聚集在体内，当人们在食用这些甲壳类动物时其体内所含有重金属也会被人体所吸收，导致人体会出现慢性中毒[5]，表现为末梢神经炎，神经衰弱，长期食用可致癌[6]，危害人体健康。近几年来，由于人为喷洒农药、工业活动和矿石燃烧等[7]活动引起水体中重金属砷含量不断增加，对养殖水体产生污染，水产动物体内砷含量超标，水产品质量安全受到严重威胁。

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)又称大闸蟹，是中国一种重要的经济水生动物，具有较高的经济价值。因蟹肉鲜嫩多汁且营养特别丰富，富含人体必需氨基酸和不饱和脂肪酸[8]，广泛受到消费者喜爱。大闸蟹主要分布在亚洲北部和中国的东部沿海省份。目前，大部分养殖中华绒螯蟹地区都以投喂野杂鱼、螺蛳、玉米以及配合饲料为主[9]，在投喂的过程中，这些野杂鱼体内也可能存在重金属砷。蟹类喜欢栖居于江河湖泊和一些泥沙洞穴中，而重金属砷通过岩土和矿石的不断风化和冶炼后通过降雨流入水体，重金属砷除会被藻类富集外，还会沉入水底被蟹类富集，因此蟹类体内重金属残留量会明显高于鱼类[10]。根据食品安全国家标准GB 2067—2017[11]中规定，水产动物和水产品中砷制剂的含量必须在0.5 mg/kg范围之内。张明月等[12]对天津地区水产品中重金属污染状况及风险评估的研究中表明，无机砷的污染状况必须引起重视；梅光明等[13]对浙江沿海海产品无机砷污染调查及食用风险分析中表明，各类海产品中总砷的平均含量为0.36～35.91 mg/kg，有66.4%的样品有无机砷的检出，长期食用这些海产品则会对人的身体健康造成一定危害；范忠吉等[14]对云南滇东地区8个州市鱼类中砷的形态测定分析中表明，在昆明、红河及玉溪的样品中有砷形态含量超标，超标率分别为26.09%、22.22%、11.11%，数据表明应该加强对水产品中砷的含量的检测，以确保水产品质量安全和人体健康。

通过利用高效液相色谱串联电感耦合等离子体质谱仪(HPLC-ICP-MS)建立一种高效检测中华绒螯蟹体内重金属砷形态残留量的方法。利用此种检测方法具有分离性强、选择性高和灵敏度高[15]的特点来进行定量检测，这项技术解决了单一检测技术的精密度和准确度低的问题。高效液相色谱(HPLC)具有分离性好，前处理时间短，电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)具有干扰少、检测限低、分析速度快、杂质少、峰型尖锐等优点[16]。二者相结合旨在为建立测定中华绒螯蟹体内重金属砷含量的方法，此方法更可靠，更高效，更适合这6种砷形态的定量分析，通过对色谱柱的优化、流动相的优化、流动相pH的优化和流速的优化，得到一种更高效检测中华绒螯蟹体内砷形态含量的方法，为今后的水产品质量安全检测方法提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

测定砷形态：砷酸[As(V)]根标准溶液(AsO43-)、亚砷酸[As(Ⅲ)]根标准溶液(AsO33-)、一甲基砷酸(MMA)根标准溶液(CH3AsO32-)、二甲基砷酸(DMA)根标准溶液(C2H7AsO2)、砷甜菜碱(AsB)标准溶液(C5H11AsO2)和砷胆碱(AsC)标准溶液(C5H14AsO)，均购自中国计量科学研究院标准物质中心，按比例配制6种混合标准储备液，使用超纯水逐级稀释配制不同浓度混合标准溶液，制作标准曲线；正己烷；氨水；25 mM/LNH4H2PO4溶液；超纯水；流动相上机之前需超声40 min。

Agilent 8900 HPLC-ICP-MS（美国安捷伦科技有限公司）；Master-Q UT水纯化系统（上海和泰仪器有限公司）；GL-22MS高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；KQ3200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

试验过程中所使用的烧杯、玻璃棒、容量瓶、移液管等玻璃仪器均用5%硝酸溶液浸泡24 h以上，使用前用超纯水润洗干净，避免因容器壁表面存有其它杂质离子影响试验结果。实验室用水均为超纯水，所用试剂均为优级纯。

1.2 样品前处理

将采集的新鲜中华绒螯蟹洗净，用镊子、勺子、剪刀等工具去壳、去腮后，用勺子刮出中华绒螯蟹的可食用部位，用绞肉机打成匀浆，放入冰箱-20℃保存，待测。

样品前处理：用电子天平称取处理好的螃蟹样本1.0 g左右（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入20 mL的0.25 mM/L NH4H2PO4溶液提取样本中的砷形态，将离心管放置涡旋仪，以2500 rpm转速涡旋5 min，超声波仪超声30 min，超声结束后放置高速冷冻离心机内，以10000 rpm转速离心15 min，完成后取出用移液枪吸取上清液10 mL至另一个50 mL离心管，加入10 mL正己烷脱脂，并继续上述涡旋、离心步骤，第二次离心结束后取出，用一次性针管吸取1 mL下清液经0.22 μm有机相滤膜过滤至自动进样螺旋瓶中，等待上机检测。

1.3 仪器程序参数分析

表1 HPLC-ICP-MS程序参数

1.4 数据分析

本试验所测数据均由Excel 2019进行处理和分析，用Origin2018软件作图，提高试验数据的准确性和可靠性。

2 结果与分析

2.1 中华绒螯蟹中测定砷形态条件的优选

2.1.1 色谱柱的优选 本试验采用Dionex IonPacTMAS19(4×250 mm)阴离子交换柱和Hamilton PRP-X100阴离子交换柱(250 mm×4.1 mm,10 μm)对20 μg/L的6种砷形态的混合标准溶液进行分离。选用流动相A：25 mM/LNH4H2PO4(pH 8.9)溶液；流动相B：超纯水，且A相比B相=99:1（体积比），流速为1 mL/min进行洗脱。在本试验过程中发现，采用Dionex IonPacTMAS19(4×250 mm)阴离子交换柱作为色谱柱时，等待出峰时间较长，会出现连峰，部分峰型紧凑，AsC和AsB不能很好地分离，出峰不完全（图1a）；当选择Hamilton PRP-X100色谱柱时（图1b），会发现这种色谱柱出峰效果会优于第一种色谱柱，虽然也会出现AsC和AsB分离不完全现象，但是等待出峰时间较短，在10 min时6种砷形态全部出峰，Hamilton PRPX100色谱柱显著优势为价格低，出峰时间相对较短，峰型尖锐，响应值较高，因此在二者对比之下，选择Hamilton PRP-X100色谱柱作为测定6种砷形态的分析柱，为试验的下一步优选做好准备。

图1 两种不同类型色谱柱分离6种砷形态色谱图

2.1.2 流动相的优选 在上述优选后，最终选择Hamilton PRP X-100(250 mm×4.1 mm,10 μm)阴离子交换柱。本试验采用4种流动相对6种砷形态进行分离洗脱，分别采用流动相10 mM/L无水乙酸钠、3 mM/L硝酸钾、10 mM/L磷酸二氢钠、0.2 mM/L乙二胺四乙酸二钠的复合盐；25 mM/L磷酸二氢铵；10 mM/L磷酸氢铵和50 mM/L碳酸铵来检验这4种流动相对6种砷形态的分离效果（见表2）。试验表明：在序号4中50 mM/L(NH4)2CO3(pH 10)时，DMA不能被有效洗脱且AsC和AsB不能完全分离；序号为1、2、3的洗脱条件下，6种砷形态都能够被洗脱分离，但是在序号2的洗脱条件下，当pH 8.0时分离效果最好（图2），并且为梯度洗脱，分离速度较快，在10 min之内6种砷形态能够完全分离洗脱，通过单标定性，6种砷形态的分离洗脱顺序为AsC、AsB、As(Ⅲ)、DMA、MMA和As(V)。

图2 4种流动相分离6种砷形态色谱图

表2 洗脱条件选择

2.1.3 流动相pH的优选 上述4种流动相在采用离子交换色谱时，由于各个砷形态在不同pH下表面电荷也不同，流动相的pH对保留时间以及分离度的影响也比较大。试验结果表明第一种流动相，A相：10 mM/L无水乙酸钠、3 mM/L硝酸钾、10 mM/L磷酸二氢钠、0.2 mM/L乙二胺四乙酸二钠的缓冲液，氨水调节pH 8.4，B相：无水乙醇(C2H6O)，两者体积比为99:1。采用两种pH值做对比，当pH 7.5时，As(V)并未检出，但当pH 8.0时，6种砷形态均被检出，基线分离较好，且AsB能够与基线分离，10 min之内能够完全出峰（图3）。第二种流动相是碳酸铵，试验结果显示：当pH 8.3时，可看出峰型紧凑，有连峰现象，As(V)并未出峰，且在5 min之内分离5种砷形态；当pH 10时，峰型尖锐，响应值较高，但DMA并未分离，说明这种流动相以及pH并不适用于本方法（图4）。第三种流动相为磷酸氢铵，pH 7时，明显看出连峰且砷形态分离不完整；当pH 8.0时，虽峰型分离完整但是基线不稳，噪音较大（图5）。第四种流动相为磷酸二氢铵，不同pH值所呈现的分离效果就不同，当pH 7.0时，只分离出三种砷形态；当pH 8.0时，发现分离效果和基线稳定性都较好，因此经过不断试验和研究后发现选用磷酸二氢铵作为流动相pH 8.0时，6种砷形态的分离效果均达到理想状态，峰型尖锐，响应值较高，最后选择磷酸二氢铵(pH 8.0)作为流动相（图6）。

图3 不同pH的峰型图

图4 碳酸铵作为流动相时不同pH的峰型图

图5 磷酸氢铵作为流动相时不同pH的峰型图

图6 磷酸二氢铵作为流动相时不同pH的峰型图

2.1.4 流速的优选 为了有效观察不同流速对6种砷形态化合物分离得影响，本试验采用1.0和1.4 mL/min流速进行洗脱。试验表明，随着流速增加，6种砷形态化合物保留时间均有不同程度缩短，但是随着流速增加的同时，基线噪音也会越来越大，而流速较慢的时候峰形均有不同程度拖尾，所以综合考虑后选用1 mL/min进行洗脱，而且这种情况下6种砷形态完全分离，并且响应值高，基线稳，无噪音。

表3 梯度洗脱条件

表4 等度洗脱条件

2.2 砷形态的方法学验证

2.2.1 方法检测限及线性范围 分别配制0、0.5、1、2、5、10、20、50 μg/L系列砷形态混合标准溶液，在上述优化后的一系列试验条件下进行分析。结果表明在0～50 μg/L范围内，6种砷化合物的响应色谱峰面积值与浓度呈良好的线性关系，相关系数均大于0.999。如表5所示，6种砷形态中，其检测限范围为0.0060～0.0912 μg/kg，定量限为0.020～0.304 μg/kg。

表5 测定曲线线性关系及方法检测限与定量限

2.2.2 方法的准确度和精密度的验证 采用加标回收率试验进一步验证本方法的准确度和精密度。准确称取中华绒螯蟹样品，分别添加3种不同质量浓度水平的AsC、AsB、As(Ⅲ)、DMA、MMA、As(Ⅴ)6种砷形态混合标准溶液，加标浓度分别为0.5、5、50 μg/L，每个梯度下设置3个平行试验，进行加标回收试验，计算添加回收率和RSD值，同时做样品本底值测定。添加回收率测定结果见表6所示，结果表明在高、中、低3个加标浓度下，6种不同砷形态物加标回收率在70%～120%之间，相对标准偏差RSD值均小于5%，满足分析检测要求，进一步证实了本方法测定结果准确性好、精密度高。

表6 中华绒螯蟹样品中6种砷形态加标回收率测定(n=3)

3 讨论

3.1 砷形态的检测

砷是自然环境中的一种有剧毒的元素，目前砷污染已经成为全球关注的问题[17]。砷的主要来源是由于自然形成和人为活动产生，在采矿和煤炭燃烧过程中都是砷的重要来源，这些砷会释放到大气中，通过大气沉降最后流入水体和土壤中，地表水会被作为饮用水和植物灌溉，因此不仅会对人类健康造成威胁也会对植物产生危害。在水环境中，砷对海产品影响小于淡水产品，原因在于淡水中缺乏可以聚集砷的藻类。水体中还会存在水动力，砷会积累在沉积物中且也能从沉积物中释放到生物体内，不同形态的砷其毒性不同且在生物体内可以相互转化[18]。水产品中的砷是人们摄入体内的重要来源之一[19]，增加人体的膳食风险。砷的毒性强弱与它的形态有关，无机砷的毒性远远大于有机砷[20]，目前，除了AsB和AsC被认为无毒之外，MMA和DMA也被列为潜在的致癌物[21]。因此，对淡水和海水产品中不同形态砷的检测至关重要，朱有涛等[22]采用HPLC串联ICP-MS的方法测定水产品中的6种砷形态，得出此方法具有简单、灵敏度高的优点，对水产品中不同形态砷的检测有重大意义；杨艳等[23]采用同样方法检测海产品中不同形态砷，结果表明，海产品中的砷主要以有机砷的形态存在，该分析方法简便可靠，符合对海产品砷化合物的检测。

3.2 前处理方法的选择

在水产品中重金属含量检测的过程中，水产品前处理方法的选择是关键步骤之一。对中华绒螯蟹可食部位前处理过程是否完全，都会影响色谱图的峰型分离情况，同时高效液相色谱的性能也会影响分离效果和组成成分的信号强弱[24]。吕超等[25]考察了采用10% HNO3作为提取液，发现硝酸会使As(Ⅲ)氧化成As(V)，在形态上也会互相转变，同时HNO3还会腐蚀进样系统，对试验仪器造成一定损害；崔艳梅等[26]发现用超纯水作为提取剂会使提取率低于其他提取剂；本试验的前处理方法主要是采取与流动相相同基质的0.25 mM/L NH4H2PO4作为提取液，经过两次涡旋和离心后，采用正己烷脱脂，最后取下清液上机待测。此方法通过超声辅助提取能够很好的分离中华绒螯蟹体内6种不同砷形态，同时此方法简单快速，且回收率较高。

3.3 分析方法的选择

本试验的分析方法采用HPLC-ICP-MS来检测中华绒螯蟹可食用部分的重金属砷含量。此仪器具有灵敏度高、检测快、效率高等优点。在前几年对水产品中重金属的检测方法是采用银盐法和高浓度盐酸提取后用原子荧光光度计测定[27]，该方法的缺点在于提取时间过长，灵敏度较低而且提取效果差，同时对试验仪器污染较为严重，已经不能满足对水产品重金属含量快速而又高效的检测。而今联用技术用于水产品检测越来越多，主要是因为HPLC具有高效分离的作用，ICPMS具有检测限低、检测元素多样、线性范围广等优点[28]。韦丽丽[29]等采用热浸提-高效液相色谱等度分离-原子荧光光谱法测定水产品中4种砷形态，其加标回收率为84%～98%，该方法准确度高，适用于水产品砷形态的检测；刘淑晗等[30]采用高效液相色谱-（紫外）氢化物发生原子荧光光谱[HPLC-(UV)HG-AFS]分析方法检测南极磷虾及其制品中的6种砷形态，该分析方法的加标回收率达到89%～108%，得出结论为该方法回收率好，结果稳定可靠，适用于本试验的检测和分析。陆奕娜等[31]采用HPLC-ICP-MS的方法对海产品中9种不同形态砷进行检测，回收率达到74%～109%；谭秀慧等[32]也采用这方法检测水产品中5种不同形态的砷，回收率达到90%～102%，说明采用此分析方法具有分离速度快、检测灵敏高、线性范围宽、检测范围广等优点，才会被广泛应用于水产品中不同形态砷的检测[33]。

4 结论

本研究通过对色谱柱的优选、流动相组成的优选、流动相pH的优选、流动相梯度的优选等色谱条件的优化，建立了HPLC-ICP-MS同时测定AsC、AsB、As(Ⅲ)、DMA、MMA和As(Ⅴ)6种砷形态方法。经过本次试验发现建立中华绒螯蟹体内砷形态方法是选用Hamilton PRP X-100(250 mm×4.1 mm,10 um)阴离子交换柱作为分析柱，流动相A：25 mM/L NH4H2PO4(pH 8.0)溶液；流动相B：超纯水；流速1.0 mL/min，梯度洗脱这6种砷形态时出峰效果更好，对基线噪音影响更小，峰型尖锐，是一种高效测定中华绒螯蟹体内重金属砷形态含量的方法。此方法对6种形态砷形态化合物分离度较好，在同种分析方法对比中，本试验的加标回收率高，达到70%～120%。经方法学验证，并通过对实际样品的检测分析，确定了此方法也可用于海产品中砷形态的含量测定，为检测水产品中砷化合物的相关研究提供了可靠的技术依据。