地不容种子休眠及其破除方法研究*

施守涛，李村富，刘正杰，林春，杜江，苏为耿，毛自朝,4

(1.云南农业大学农学与生物技术学院，云南 昆明 650201 ；2.云南生物谷药业股份有限公司，云南 昆明 650503；3.云南省林业和草原技术推广总站，云南 昆明 650204 ；4.云南农业大学特色小宗作物研究中心，云南 昆明 650201 )

地不容(StephaniaepigaeaLo)属毛茛目(Ranunculales)防己科(Menispermaceae)千金藤属(Stephania)多年生草质藤本植物，是我国的传统中药，以块根入药，在西南等地广泛应用于消肿散淤、健胃止痛以及风湿性关节炎、疟疾治疗和促进术后白细胞生长等[1]。主要活性成分为生物碱，已分离鉴定的化合物有原小檗型[2]、阿朴菲型[3]、原阿朴啡型[4]、吗啡型[5]、双苄基异喹啉型生物碱[6]等，其中千金藤素在地不容中含量较高，达1.3%，对放疗或白细胞减少症具良好效果[7-9]。

地不容的块根形似乌龟，上部美观，生长迅速、绿化面积大、管理容易，常用于园林景观及绿化，开发利用前景广阔。地不容为雌雄异株，授粉需要一定的种群数量，加之种子自身存在休眠现象，因此自然结实率和种子繁殖力相对较低。在市场经济利益的驱使下，乱采滥挖进一步加剧了野生资源的减少，因此，通过采挖野生块茎繁殖已经远不能满足其市场需求。

开展种子繁殖、茎段扦插、组培快繁等研究，是解决当前地不容资源不足的重要途径。生产实践中，地不容种子具有休眠特性，现采现播难以萌发，但其休眠机制和解除方法尚未见报道。本研究为明确地不容种子的休眠机制，采用机械划破种皮、摩擦处理、热水及硫酸浸泡等方法处理其种子，比较不同处理方法对解除种子休眠的效果，以期为种子育苗及种质资源保护与利用等提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

地不容植株为野外引种，移栽于云南农业大学试验大棚。2018年8月采集其成熟后的果实，去除果肉后自然晾干种子，备用。地不容的种子外形呈马蹄形(图1c)，平均直径0.51 cm，千粒重18.81 g。

供试药剂主要有红四氮唑(1%TTC，298-96-4，购于上海源叶生物科技有限公司)、H2SO4、NaOH等均为分析纯(广东省佛山市华希盛化工有限公司)。试验在云南农业大学特色小宗作物研究所完成。

1.2 试验方法

1.2.1 地不容种子活力检测

(1)种子生活力检测 在人工去种皮时，除去了不饱满、腐烂、组织软化等种胚，挑选饱满白色种胚(图1e)的地不容种子，备用。采用红四氮唑(1%TTC)染色法[10]测定新采收的地不容种子活力，胚被染成有光泽鲜红色的(图1f)记为组织状态正常有活力的种子。每重复处理50粒种子，重复3次，取平均值。

(2)萌发试验 取不做任何处理的地不容饱满种子在培养皿中进行发芽试验，萌发床为经高温灭菌滤纸，光照条件20 μmol/(m2·s)，12 h/d(每天光照时间为12 h)，温度(25±2)℃下培养。以下所有处理的萌发条件都保持一致，每个培养皿50粒种子，重复3次，分别在试验14、28 d后统计种子发芽势和萌发率，之后的试验数据测定与此保持一致。

(3)吸水率 随机取50粒饱满种子于去离子水中浸泡，置于25 ℃恒温培养箱中，每隔6 h取出种子，用滤纸吸干种子表面水分称重，直到种子吸水量不会再增加[11]。

(4)萌发抑制物质存在与否的生物检测 为确定地不容种子是否含萌发抑制物，取地不容种子的种皮2～4 g在研钵中捣碎后溶于40 mL的去离子水中，置于25 ℃恒温箱内浸提48 h;使用小白菜(Brassicarapavar.glabra) 种子做为生物测定种子，在9 cm培养皿中，以滤纸为萌发床，加3 mL种皮浸提液，播小白菜种子50粒，置于25 ℃恒温培养箱中暗培养，24 h后测小白菜种子的发芽率，培养48 h后测其种子的胚根长度[12]。对照组将浸提液替换为3 mL去离子水，其他培养条件保持一致。

1.2.2 物理方法处理

(1)划破种皮处理 为探究透气性对种子萌发的影响，对种皮进行不同程度处理：在胚根端开孔、去1/4种皮、去1/2种皮、完全去除种皮，将处理过的种子进行滤纸萌发试验。

(2)摩擦处理 取两张砂纸，将种子置于中间，两张砂纸水平做相对旋转摩擦种子[13]，在尽量保证种胚的完整性的基础上，使种皮产生一定程度的擦破，处理干净种皮的碎屑，进行滤纸萌发试验。

(3)热水处理 在1 L的烧杯中分别用500 mL初温为40、50、60、70、80、90、100 ℃的7种温度的水浸泡种子至水温到达室温[14]，浸泡时用培养皿盖住，进行滤纸萌发试验。

1.2.3 化学试剂处理

(1)浓H2SO4处理 将种子放入250 mL的烧杯中，加浓度为98%的浓H2SO4(比重1.84)，用玻璃棒不停搅拌，分别浸种10、20、30、40、50、60、70 min，浓H2SO4处理完后立即取出用流水冲洗10 min[15]，进行滤纸发芽试验。

(2)NaOH处理 将种子放入250 mL的烧杯中，用40%、30%、20%、10%的NaOH[16]溶液分别浸泡20、40、60、80、100、120、140 min，不同浓度、时间组合处理后立即取出用流水冲洗10 min，进行滤纸发芽试验。

1.2.4 数据处理

试验数据用Excel 2010进行差异显著性分析。

吸水率(%)=(吸水前-吸水后)/吸水前×100%；

萌发率(%)= 种子发芽数/供试种子总数×100%；

发芽势(%)=发芽势天数内正常发芽种子粒数/试验种子的总粒数×100%。

2 结果与分析

2.1 种子活力、吸水率和生物检测

种子生活力是种子发芽的潜在能力或种胚具有的生命力，具有生活力的种子不一定都具有发芽能力，如果种子生活力显著大于种子发芽率，说明种子存在休眠现象[10]。TTC染色结果(图1f)表明种子生活力为100%，而不做任何处理的完整种子萌发率为0，种子生活力远远大于发芽率，说明新采收的地不容种子存在显著的休眠现象。

图1 地不容植株、果实与种子

地不容种子种皮为硬木质化(图1c)，如图2所示，种子在前6 h内快速吸水，6～48 h进入缓慢吸水期，48 h后种子含水量达到饱和，在一定程度上说明，种子不存在吸水障碍问题，种皮有较好的透水性，表明种皮透水性不是引起种子休眠的原因。

图2 地不容种子吸水率

很多具有休眠性的植物种子都含有抑制萌发的物质，试验中常常通过测定种子浸提液对小白菜种子发芽抑制作用来确定种子抑制物质的存在与否[17]。为确定地不容种子是否含萌发抑制物，采用相同的方法测定表明，对照组与地不容种子浸提液对白菜种子萌发率、胚根长没有显著性差异，且根生长形态和根毛稀疏程度未存在较大差异(表1)，说明种皮中不存在抑制萌发的物质，进一步明确了地不容种子休眠是由种皮机械束缚导致的。

表1 种皮浸提液对种子萌发及胚根伸长的影响

2.2 物理处理对种子萌发的影响

对种皮不同程度的处理，能解除种胚与外界的隔离，增强胚的气体交换和吸胀能力。由表2可见，在胚根端开小孔，帮助地不容种胚与外界进行气体交换，种子仍不能萌发。在种子萌发过程中，去1/4、1/2种皮、完全去除种皮等3种处理后的种子在4～5 d后开始萌发，且去1/2种皮具有最高的萌发率，达96%。方差分析结果表明：去除1/4、1/2种皮、完全去除种皮之间萌发率没有显著性差异，且去除1/4、1/2种皮、完全去除种皮的种子在14 d 的萌发率几乎与28 d的萌发率相等，说明种皮障碍束缚一旦被破除，种子萌发就能启动。结果表明：种皮透气性不是引起地不容种子休眠的原因，种皮束缚才可能是导致地不容种子休眠的原因。

表2 不同物理处理对种子萌发的影响

在种皮机械束缚导致种子休眠的解除方法中使用机械摩擦较为普遍，其中砂纸摩擦可以使种皮均匀变薄或者擦破局部种皮，让种胚失去与外界的隔离以及减少种皮机械束缚，增强胚的气体交换和吸胀能力，加快种子萌发。由表2可见，经摩擦处理后地不容种子的萌发率约达63.33%，低于人工去种皮，原因可能是砂纸在摩擦过程中对种胚造成一定程度伤害或摩擦不均匀导致种胚不能冲破残留种皮的束缚而萌发，该结果也证明种皮束缚是地不容种子萌发率低的主要限制因素。

高温处理不仅对种皮具有一定的软化作用，降低机械束缚，而且可以溶解种皮内的蜡质和油脂，增加种皮的透性，以及浸出种子内源抑制物等其他原因引起的种子休眠，具有操作方法简单、经济实惠及效果显著等优点[14]。经热水处理后的种子萌发率为0(表2)，表明热水处理对地不容种皮机械束缚的解除无效果，说明地不容种子可能对高温敏感，或是地不容种皮的硬实程度较高，通过高温热水的软化仍不能破除休眠。

2.3 化学试剂对种子萌发的影响

用浓H2SO4处理可以腐蚀种皮，使种皮变薄，减少种皮对胚的机械束缚[19]。种子用浓H2SO4处理20 min后流水冲洗10 min，地不容种子的硬实骨质种皮外层开始脱落，主要是覆盖背部的小肋横角质部分；处理60 min，种皮完全脱落，种子内部完全裸露。种皮与种胚之间有胚乳(图1d)，其所占比例较小，对胚起到一层膜的保护作用，在浓H2SO4处理过程中，可在一定程度上防止对种胚造成迅速酸害。由表3可见，处理50 min后，地不容种子开始萌发，处理60 min时萌发率最高，达88.67%。处理70 min后种子萌发率不升高反而降低。由此可见，通过浓H2SO4浸种可有效解除种皮束缚进而打破地不容种子休眠，但处理时间过长会对种胚造成一定程度的酸害。

表3 不同化学试剂及处理时间对种子萌发率的影响

NaOH是强碱，有强烈的腐蚀性，对一些种皮薄的种子可以减轻种皮的束缚作用，解除种子休眠。经不同浓度NaOH浸泡不同时间处理的地不容种子，在培养14 、28 d后统计发现其发芽势和萌发率都为0，表明NaOH处理未能打破种子休眠，对解除地不容种子休眠无效果。在试验过程中发现：经NaOH处理、流水冲洗10 min的种子，在萌发床滤纸上种子周围逐渐变黑，更换3次滤纸后仍有这种现象。由于地不容种皮具有较好的透性，变黑的原因可能是NaOH溶液渗入种皮内部后有残留，流水不能将其清洗干净，导致种胚被腐蚀，种子未萌发，其发芽势和萌发率均为0。

3 讨论与结论

3.1 地不容种子休眠

休眠是种子植物为了种群的生存和发展，在长期进化过程中逐渐演化形成的对不良环境的有效适应机制。为适应不同的胁迫环境，植物种子进化形成了不同的休眠类型及机制[18]。从生殖发育看，采用种子播种进行地不容育苗需2～3 a后植株才开花，并于当年7—9月结实。破除休眠的种子在翌年3月才开始萌发，从果实成熟到来年种子发芽需要6～8个月的时间，休眠有利于地不容度过不适宜其萌发和生长的寒冷干燥的冬季。成熟的地不容果实为鲜艳红色(图1b)，是许多鸟类等动物喜爱的食物，利于种子远距离传播。其坚实的种皮有利于动物类过腹后与粪便一起发酵仍能保证种子在来年更适宜的生长条件下萌发及生长，成功实现后代的繁衍，保持物种的延续[20]。Jerry等[21]在对Nikolaeva[22]休眠分类系统进行修订和完善的基础上提出了新的分类系统，将种子休眠概括为5种类型，分别是：物理休眠[23-24]、生理休眠、形态休眠、形态生理休眠和复合型休眠[25]。在本研究中，地不容果实变红后采收，种胚已发育完全，有较好的染色率(图1f)及萌发率，故不存在胚的形态休眠；地不容种皮具有较好的透性，也排除由于种皮或果皮的不透气、不透水从而抑制种子萌发引起的物理休眠；经生物检测试验说明地不容种皮中也不存在抑制萌发的物质(表1)，证明地不容坚硬的种皮束缚是限制其种子萌发的主要因素，符合Jerry分类系统中生理休眠的描述：种子种皮能够透水，种胚也分化完全，但种胚的生理抑制作用阻碍了种子的萌发；或种胚的生长力较弱，不能突破种皮等包被物的束缚同样对胚的萌发具有抑制作用[19]。因此，本研究结论认为：导致地不容种子休眠的主要原因是种皮束缚，破除种皮障碍是解决地不容休眠的主要方式。

3.2 机械处理对地不容种子萌发的影响

机械处理是解决种皮障碍最直接、有效、简单的方法，包括划破种皮、摩擦处理和轻辗等[25]，地不容种子由于种皮厚度不均(图1c)，不宜轻捣或轻辗。伊风艳等[26]用砂纸打磨和划破种皮处理野生黄花苜蓿(Medicagofalcata)种子，使得其发芽率高达93%；李欣瑞等[13]经过摩擦处理和划破种皮处理的武陵假俭草(Eremochloaophiuroides)种子，发芽率分别达93.33%和88.67%；侯文焕等[27]用沙子研磨菜用黄麻(Corchoruscapsularis)种子，结果发现该处理也能显著地提高其发芽率。在本研究中经划破种皮和摩擦处理过的地不容种子，种子发芽率都显著提高，达96%和63.33%，可见通过以上2种方法处理可有效破坏种皮，减少胚根突破种皮时受到的机械阻力，促进种子萌发。但是这两种种子处理方法效率较低，处理过程中也会误伤种胚，只适用于处理样品量少的情况。

3.3 热水处理对地不容种子萌发的影响

热水浸种可软化种皮，改善种子的透气性，有利于种子突破种皮障碍，是一种操作简单、经济环保、效果显著，且可大量处理种子的方法[27]。在苏晓敏等[14]研究中用热水浸种对苦豆子(Sophoraalopecuroides)、金合欢(Acaciafarnesiana)、银合欢(Leucaenaglauca)、台湾相思(Acaciaconfusa)、任豆(Zeniainsignis)等5种植物种子解除其休眠的效果极为为显著，这些种子经70 ℃热水浸种30 min后发芽势和发芽指数均达到试验期间的较大值，萌发率可达78%、75%、90%、66%、100%，分别为对照萌发率的2.1倍、4.4倍、3.3倍、3.7倍和8倍；但在其他种子[如百喜草(Paspalumnatatu)、田菁(Sesbaniacannabina)、马棘(Indigoferapseudotinctoria)、黄槐决明(Cassiasurattensis)]的休眠打破研究中，热水处理效果并不明显，甚至导致萌发率下降，而且在试验中随着浸种水温度升高、时间延长，对种胚损伤严重，腐烂种子数也有增多。本研究用相似的方法处理地不容种子，热水处理过后的种子，在试验28 d后其种子仍未萌发，说明热水处理对地不容种子萌发没有效果，生产中不宜采用。这种无效处理的原因，可能是由于热水没有起到软化种皮的作用或有软化种皮的作用但对种胚造成一定伤害，其具体原因尚待进一步研究。

3.4 化学试剂处理对地不容种子萌发的影响

除了物理处理方法外，化学试剂处理也常常被用于促进种子萌发，高浓度的硫酸和NaOH可以腐蚀局部种皮，促进种子萌发，其中使用浓硫酸最为普遍。岳利军[29]用浓硫酸预处理，能提高梭梭(Haloxylonammodendron)、白刺(Nitrariatangutorum)和红砂(Reaumuriasoongorica)的种子发芽率。由于植物种皮厚度存在差异，不同物种浓硫酸浸泡时间也存在差异，如甘肃棘豆(Oxytropiskansuensis)的最佳处理时间为5 min，甘草(Glycyrrhizauralensis)[30]和地八角(Astragalusbhotanensis)[31]的为20 min，白刺花(Sophoraviciifolia)为25 min[32]。对于地不容种子，用浓硫酸处理时间达50 min时种子开始萌发，60 min时萌发率最高，达88.67%，70 min后种子萌发率降低。在其他物种的种皮障碍休眠破除中，NaOH也同样有效，但效果因物种不同而异，如用10%或20%的NaOH浸种4～10 h，异穗苔草(Carexheterostachya)种子的发芽率由0提高到90%以上[33]；结缕草(ZoysiajaponicaSteud)种子用30%NaOH 浸泡20～80 min，种子发芽率可达80%，高于对照30%[34]；而黑果枸杞(Lyciumruthenicum)的种子用浓度40%NaOH处理过后，其平均发芽势、发芽率与对照组相比没有显著变化[35]。研究发现碱液浸泡处理种子无法破除休眠的原因，可能是碱液不能破坏种皮中高含量钙盐或硅酸盐的栅状细胞或石细胞，或对木质化程度极高的细胞壁的软化能力有限[36]。本研究中，经不同浓度的NaOH不同时间组合处理的地不容种子，其发芽势和萌发率都为0，未能打破休眠，可能与地不容坚硬的种皮使NaOH溶液对其软化能力有限或浸泡过程中伤害种胚有关，但其无效机制还有待研究。本研究通过不同浓硫酸不同时间处理种子后，经种胚形态和萌发率的比较分析，确定60 min浓硫酸处理后地不容种子种皮完全脱离，种皮障碍被打破，萌发率高达88.67%，可作为打破地不容种子休眠、进行其规模化育苗的首选方法。

综上所述，本研究确定地不容休眠的主要机制是种皮障碍，通过摩擦处理、划破种皮和98%浓H2SO4处理，均可破除地不容种皮束缚，促进种子萌发，不同处理方法的萌发率最高可达63.33%、96%、88.67%。其中，机械处理方法能大幅度提高地不容种子萌发率，但该方法只适用于少量种子处理。若要处理大量地不容种子，建议采用98%浓H2SO4浸种60 min的方法，种子萌发效果最好。