红豆草种子形态和营养成分遗传变异分析

魏少萍， 李景峰， 梁鹏飞， 陈 洁， 刘 鑫， 南丽丽

(甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室， 甘肃 兰州 730070)

红豆草(Onobrychisviciaefolia)为豆科(Leguminosae)驴食草属(OnobrychisMill)深根型草本植物，播种当年根系生长迅速，适应环境的可塑性大，含有丰富的植物蛋白，广泛用于城市绿地工程建设、水土保持工程建设、草田轮作、绿肥、混播和再生体系建立等[1-2]。植物表型是基因和环境共同作用的结果，反映了基因型在长期的环境变化压力适应下的新选择[3]。而种子生长环境与其他营养器官相比较为封闭，受到的外界环境因子的影响较小，因此，种子形态特征相对稳定[4]。植物种子形态主要受遗传因素控制，但在不同的分布区域也会由于适应不同的生境而产生新表型，因此表型变异往往在适应和进化上有重要意义[5]。对种子形态特征和营养成分的研究对植物优良品种选育和品种鉴定具有较大的潜力。种子形态特征经常作为研究对象用以区分种类。

以往对红豆草的研究主要集中在改土效益[6]、诱变选育[7]、基因克隆[8]、抗病性[9]、光合特征[10]、提纯复壮[11]、抗逆性[12-13]及ISSR体系优化[14]等方面，而有关红豆草种子形态及营养成分变异方面的研究少见报道。种子表型特征变异是植物遗传变异的重要特征之一，在遗传分类学上具有重要研究价值[15]。种子的形态特征是识别种子的重要依据，其与种子的扩散传播能力、种子的萌发、幼苗定植，甚至种群的分布格局密切相关[16]。牧草种子的外部形态是各种牧草种子真实性和纯度鉴定以及进行种子分级和检验的主要依据[17]。

本研究以国内外22份红豆草种质资源为供试材料，研究红豆草种子的面积、周长、长宽比、长度、宽度和千粒重等形态指标及种子中粗蛋白、粗脂肪、淀粉和水分等主要营养成分，通过方差分析、相关分析、主成分分析和聚类分析等综合评价红豆草种质的特性，深入探讨红豆草种质的变异情况，以期为筛选和综合评价红豆草优异新品种、种质鉴定及种质资源保护提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试红豆草材料共22份，其中编号1，6，2323-1，1626，1668，1994，2049，2208，2323-2，2559，2668，7456，9155，9602，9699，9860，9977，10295，13523，13709共20份由农业部全国畜牧兽医总站牧草种质资源搜集保护项目协作组(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所)从俄罗斯瓦维洛夫植物基因库引进，‘蒙农红豆草’(Onobrychisviciaefolia‘Mengnong’，MN，育成品种)种子由内蒙古农业大学提供，‘甘肃红豆草’(Onobrychisviciaefolia‘Gansu’，GS，地方品种)种子由甘肃农业大学提供。

1.2 试验地概况

将22份材料于2019年4月3日种植在甘肃农业大学武威黄羊镇牧草试验站(37°55′ N，102°40′ E)。该站海拔1 550.88 m，年均温7.2℃，年降水量150 mm，年蒸发量2 019.9 mm，无霜期154 d，属于温带干旱荒漠气候，土壤类型为沙壤土[18]。人工开沟条播，播种深度3～4 cm，播种量60 kg·hm-2，小区面积20 m2(4.0 m×5.0 m)，小区间隔0.5 m。播前浇一次底墒水，生长期间，不施肥，于红豆草出苗期、分枝期、现蕾期漫灌。现蕾期后每小区使用隔离网以防发生杂交，并在每小区放养熊蜂授粉，于2020年6月下旬待80%的荚果呈黑褐色时采集各材料的种子，带回实验室自然干燥后在种子袋中保存备用。

1.3 种子功能性状测定

采用多功能种子分析仪(1903817S)对22份红豆草种质进行种子功能性状分析，每份种质300粒，测量种子的面积、周长、长宽比、长度、宽度。

具体操作如下：先将干净的种子均匀的平铺于背光板上，将高拍仪调整至适合的高度后，采用ScanMaker i600 Plus上下LED双光源彩色扫描仪扫描种子，进行种子图像采集。然后，根据工作区范围进行二值和反色设置后，即可启动图像分析系统，将种子大小及形态性状数字化，之后进一步分析和处理数据。

参照我国GB/T3543.7-1995《农作物种子检验规程其他项目检验》[19]文件中千粒重的测定方法，采用千粒法测定其带荚千粒重。

1.4 种子发芽力测定

参考《草种子检验规程发芽实验(GB/T 2930.4-2017)》[20]，发芽试验采用纸上发芽法。从去掉荚果的充分混合的净种子中随机数取种子，每重复100粒，重复4次，整齐摆放在铺有2张滤纸的培养盒(12 cm×12 cm)中，预先4℃冷冻7 d后置于变温为20℃/30℃、光暗周期为16 h/8 h的光照培养箱中培养，从第2 d开始记录，期间保持滤纸湿润，第10 d后连续没有种子发芽，故第14 d为末次计数时间，第4 d计算发芽势，第10 d测定根长，并计算发芽指数、发芽率。

1.5 种子营养成分测定

取不同红豆草材料种子于105℃烘箱中烘干至恒定质量后在研钵中磨碎，取样测定相关指标，各指标重复3次。粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定，淀粉含量采用蒽酮显色法测定[21]，使用全自动脂肪测定仪(1804190S)测定粗脂肪，磷含量采用氢醌-亚硫酸钠比色法测定，含水量采用我国农业部颁布的GB3543-83《农作物种子检验规程》中的105℃低恒温烘干法测定[22]。

1.6 统计分析

采用多功能种子分析仪进行种子图像采集和特征获取，应用Microsoft Excel 2010软件整理数据，计算各表型指标的平均值和变异系数(平均值±标准误)，SPSS19.0软件对表型数据进行单因素方差统计分析、相关性分析、主成分分析和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 红豆草种子形态特征差异分析

由表1和图1可知，不同来源红豆草种子的面积、周长、长度、宽度、千粒重、根长、种皮色泽存在显著差异(P<0.05)。种子面积均值为8.20 mm2，变化幅度为6.83～9.21 mm2，其中10295号面积最小，2668号最大，后者是前者的1.35倍；周长均值为10.91 mm，变化幅度为10.00～11.65 mm，其中10295号周长最小，9155号最大，后者是前者的1.17倍；长宽比均值为1.35，变化范围为1.31～1.40，其中2323-1号长宽比最小，13709号最大；长度均值为3.88 mm，变化范围为3.60～4.20 mm，其中10295号长度最短，9155最长，后者是前者的1.17倍；宽度均值为2.88 mm，变化幅度为2.60～3.07 mm，其中10295号种子最窄，2668号最宽，后者是前者的1.18倍；千粒重均值为21.40 g，其中6号最轻(16.50 g)，是平均值的0.77倍，GS最重，达25.30 g，是平均值的1.18倍；第10 d根长均值为6.32 cm，1668号可达10.27 cm。

表1 红豆草种子主要形态特征参数Table 1 Main morphological characteristic parameters in sainfoin seeds

2.2 红豆草种子营养成分和发芽指标差异分析

由表2可知，不同来源红豆草种子主要营养成分含量差异显著(P<0.05)。其中种子粗脂肪含量变化幅度为5.56%～11.38%，GS粗脂肪含量最低，9699号最高，后者是前者的2.05倍；种子淀粉含量变化范围为4.84～24.71 mg·g-1，2049号淀粉含量最低，1994号最高，后者是前者的5.11倍；种子粗蛋白变化范围为15.86%～19.97%，2323-1号种子粗蛋白含量最低，GS最高；磷含量MN最高；平均含水量为4.63%；9977号发芽势和发芽率均最高，7456反之。比较红豆草种子各形态指标和营养指标变异系数发现，种子形态指标的变异系数变化幅度为9.1%～18.6%，平均11.56%，而营养成分含量变异系数变幅为6.7%～20.4%，平均为12.18%。

图1 供试22份红豆草种子测量图Fig.1 The survey sheet of twenty-two tested sainfoin seeds

表2 红豆草种子主要营养成分含量Table 2 Main nutrients contents in sainfoin seeds

2.3 红豆草种子特征参数的相关性分析

由表3可知，红豆草种子形态特征参数间和各营养成分含量指标间存在一定的相关性。其种子面积与种子周长、长度、宽度呈极显著正相关(P<0.01)；种子周长与种子长度、宽度呈极显著正相关(P<0.01)；种子长度与种子宽度呈极显著正相关(P<0.01)；种子千粒重与种子面积、宽度呈极显著正相关(P<0.01)，与种子周长、长度呈显著正相关(P<0.05)，与种子长宽比呈极显著负相关(P<0.01)，与种子中粗脂肪含量呈显著负相关(P<0.05)。

2.4 红豆草种子特征参数主成分分析

以上分析表明，红豆草种子不同特征参数间具有丰富的关联性，为深层解释其变化的主要原因，以种子形态特征和营养成分含量均值为指标，对22份红豆草种质的种子进行主成分分析。表4中前3个主成分累计方差达到了83.477%，因此可以选择这3个主成分进行提取分析。

表3 红豆草种子主要特征参数间相关系数Table 3 Correlation coefficients among main characteristic parameters of sainfoin seeds

表4 红豆草种子性状的特征值与主成分贡献率Table 4 Characteristic values and contribution rates of principal components of sainfoin seeds

由表5可得出第1主成分得分y1、第2主成分得分y2和第3主成分得分y3。方程为：y1=0.516x1+0.508x2+0.502x3+0.471x4+0.403x5-0.328x6-0.077x7+0.165x8-0.254x9

(1)

y2=0.022x1+0.078x2+0.104x3+0.184x4-0.254x5+0.337x6+0.638x7+0.324x8-0.073x9

(2)

y3=0.143x1+0.221x2+0.261x3+0.357x4-0.249x5+0.412x6-0.085x7-0.677x8+0.570x9

(3)

Z=0.55099×y1+0.15380×y2+0.12998×y3

(4)

在第1主成分上载荷量较大的因子由大至小依次是种子宽度、种子面积、种子周长、种子长度和千粒重，集中反映了种子的形态特征；在第2主成分上载荷量较大的因子由大至小依次为粗蛋白和淀粉含量，基本反映了种子的营养成分含量特征；在第3主成分上载荷量较大的因子是粗脂肪和长宽比。主成分分析结果显示，影响红豆草种子的主要性状是种子形态特征中的宽度、面积和周长，其次为营养指标中的粗蛋白和淀粉含量。根据第1、第2、第3主成分的贡献值，可分别计算第1、第2、第3主成分的得分，并根据得分和权重(方差贡献率)的乘积得出综合得分(2)，具体计算公式分别为(1)，(2)，(3)和(4)。

表5 各指标主成分载荷矩阵Table 5 Principal component load matrix of each index

表6对22份红豆草种子材料进行主成分综合得分排名可知，编号2668，9155，GS，MN，13523，2323-2和1994综合排名较前。

2.5 聚类分析

以红豆草种子发芽力、形态特征和营养成分含量为指标，对22份红豆草种子进行聚类分析，结果如图2所示。根据聚类图可将供试22份种质种子划分为3组，第1组包括11份材料，编号分别为1626，1668，GS，13523，2208，2668，MN，1994，2049，9860和9977，其特点是种子发芽力较强、较大较圆、重量较重、主要营养成分含量较高；第2组次之，材料有9699，6，2323-2，9602，1，9155，10295和2323-1；第3组有3份材料，为2559，7456和13709，其特点是种子形态指标偏小，发芽力较弱。说明这3组材料间具有明显差异，这与前面的方差比较结果相符合，为进一步研究选育优良红豆草种质提供了基础依据。

表6 主成分得分和综合得分Table 6 Principal component score and comprehensive score

图2 供试的22份红豆草种子的聚类图Fig.2 The cluster dendrogram of twenty-two tested sainfoin seeds

3 讨论

在农业生产中，种子是最基本的生产资料，是植物遗传和变异的载体[23]，而牧草种质资源在长期的突变、基因交流、隔离和遗传分化的演化进程中，经过选择蕴藏着丰富的基因资源，具有物种多样性和遗传多样性，对于植物的栽培利用具有极为重要的意义[24]。而我国每年需要大量的牧草种子，自主培育品种少且质量不高，如果仅靠进口或野外收集，则不能满足我国草地建设的要求，因此，培育出具有我国特色的优良牧草种子在生产实践中则显得非常重要。

方升佐等[25]研究表明，不同种源种子生长的环境条件(包括气候和土壤条件)不同，种子中营养成分的积累也有所不同，从而影响种子品质的优劣。李娟等[26]的研究表明，不同种源闽楠(Phoebebournei)种子部分特征参数形态和主要营养成分含量变异由各环境因子综合作用造成。但关于造成种子形态特征和营养成分含量差异的主要原因是自身遗传变异特性还是外界环境因素尚不清楚，以至于不能完全辨析种子形态特征和营养成分含量的变异模式，科学准确的对各个种源进行划分。本试验表明，国内外22份红豆草种子的形态特征和营养成分含量差异显著。因22份材料种植于同一块试验田(武威黄羊镇牧草试验站)，其气候、海拔、土壤等环境条件一致，可大致排除外界环境因素对种子形态和营养含量的影响，推测造成这种差异的主要因素是由种子的遗传特性决定，这与张文标等[27]对导致同一区域夏腊梅(Calycanthuschinensis)果实和种子形态变异差异较大的因素可能与其母株个体的差异、果实和种子的生长位置等结论相似。

本研究相关分析表明，红豆草种子形状越近似圆形，种子内营养物质越多，则种子越重，这与众多学者研究结果一致[28-30]。此外，本研究还发现红豆草种子发芽率与种子面积、周长、长宽比、水分均呈一定的负相关关系，这可能是因为种子越小越圆，含水量很少，组织之间变得紧密坚实，其相对表面积越大，保水和吸水能力强，使得其发芽率较高。这与杨洁晶等[31]、宗文杰等[32]、张蕾等[33]认为小粒种子具有较高萌发率的研究结论相一致。

一般认为，种子内含营养物质越高，发芽迅速且整齐[34-35]。但在本研究中，成熟后的红豆草种子中粗蛋白、粗脂肪和淀粉与其发芽率、发芽势、发芽指数没有显著的相关性。种子的粗脂肪含量与粗蛋白含量、淀粉含量均呈不显著负相关，其原因可能与红豆草种子的储存条件或后熟有关，一些破损种子入库后导致脂肪的酸败或种子后熟不完全，只有少量的糖类转化为脂肪。因此，对红豆草种质优良性状的选择和亲缘关系的分类还需进一步进行田间试验并从分子水平上进行深入探讨。

4 结论

编号10295，2668，‘甘肃红豆草’，9860，9155，‘蒙农红豆草’，13709，1994，9977，7456的种子发芽力、形态性状和主要营养成分含量方面与其他材料间存在显著差异；而材料13523，2049，1994，1626，‘蒙农红豆草’的综合表现较好，其种子较圆、重量较重、主要营养成分含量较高、发芽力较强。研究结果为进一步研究红豆草的遗传多样性和选育等提供基础资料。