间充质干细胞来源外泌体与心血管疾病的研究进展

谭鑫，刘一如，康品方

心血管疾病是一种常见病、多发病，且致残率和病死率很高。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是应用最广泛的心脏疾病临床试验干细胞。过去认为移植的骨髓间充质干细胞分化成心肌细胞和支持细胞类型来修复心脏组织，然而，许多观察结果在生理上和时间上都不支持这种说法，于是出现了另一种说法，即移植的骨髓间充质干细胞通过分泌旁分泌因子，进一步促进组织修复，从而来介导其治疗效果，目前有越来越多的证据支持MSCs以旁分泌方式起到其功能作用，如MSCs来源外泌(MSC-EXs)体可单独作用与心肌修复，且在修复受损心肌方面优于MSCs[1]。许多研究[2]表明，通过干细胞治疗激活的心肌保护通路，也可以通过注射干细胞产生的外泌体来激活。

1 间充质干细胞概述

骨髓间充质干细胞是骨髓细胞中的一类，由于它们可以快速粘附在组织培养皿上,所以可以从其他骨髓来源的单核细胞中分离出来，MSCs约占有核细胞的0.001%～0.1%，可以在体外大量扩增而不丧失功能或表型。目前普遍认为MSCs可表达CD44、CD29、CD73、CD90和CD105，以及CD106、CD166、ICAM-1,但不表达造血标志物CD45、CD34、CD14、CD79a、CD11b和HLA-DR。在富含生长因子的选择性培养基中，MSCs能够分化为多种中胚层谱系和分化细胞类型，包括成骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞/肌管、胰岛细胞和心肌细胞等。而在体内，它们已被证明可以移植并转分化为心肌细胞，修复梗死的心肌细胞。进一步的研究发现，MSCs可以改善心功能,但不只是通过替换受损的心肌细胞。MSCs还分泌多种细胞因子和生长因子，这些因子以可溶性形式释放，骨髓间充质干细胞来源外泌体能对心肌产生多种作用，如改善血管生成、刺激心肌干细胞和减少心肌细胞死亡。也有证据表明其能促进成纤维细胞活化，调节细胞介导的免疫应答和减轻心肌纤维化。

2 间充质干细胞来源外泌体与心血管疾病

大量研究[3-5]表明，外泌体分泌的旁分泌因子在保护心脏过程中起到重要的作用。在小鼠心脏缺血/再灌注损伤(I/R)模型中，在再灌注前用MSC来源的外泌体治疗可显著减小梗死面积[6]。再灌注前用MSCs对小鼠进行体内治疗，显示出生物能的提高和氧化应激的降低，再灌注30 min后，经外泌体处理小鼠的ATP/ADP和NADH/NAD+比值显著升高。此外，外泌体治疗24 h后局部和全身炎症明显减少[7]。而人类间充质干细胞源性外泌体(hMSC-Exo)已在多个模型中被证明可减少I/R。抑制I/R诱导的细胞凋亡和自噬在hMSC-Exo的心脏保护作用中起关键作用[8]。I/R损伤后细胞凋亡的主要特征是ATP生成减少、氧化应激增加和细胞凋亡。在这种情况下，缺氧会抑制有氧呼吸和ATP的产生，使无氧糖酵解成为ATP产生的主要来源。ATP生成减少是心肌缺血损伤时心肌细胞死亡的一个重要特征。MSC-Exo包含糖酵解ATP生成阶段所需要的五种酶，因此研究人员推测，MSC-Exo可以增加心肌细胞中ATP的生成，并减弱其缺血后凋亡。与此推测一致，外泌体治疗可以恢复能量消耗，从而抑制心肌I/R损伤后细胞的死亡。此外，在MSC-Exo中存在的过氧化物酶和谷胱甘肽S转移酶能够降低氧化应激，而氧化应激是导致心肌细胞死亡的一个重要原因。自噬可以通过降解受损的细胞器来产生ATP，从而在轻度缺血应激条件下维持细胞活力，但在严重缺血条件下，自噬会促进细胞死亡，使心脏功能恶化。Xiao等[9]发现心肌梗死后MSC移植的有益部分是由于通过主要含有miR-125b-5p的外泌体提高了自噬通量。此外，基质衍生因子1(SDF1a)在心肌梗死(MI)后具有心脏修复功能。有研究证明SDF1在MSCs来源的外泌体中过表达抑制缺血心肌细胞自噬，促进内皮细胞微血管生成，即SDF1过表达的MSCs释放的外泌体对缺血性心肌梗死具有有益作用[10]。总之，现有的研究表明，通过改善ATP消耗和刺激通路来抑制凋亡，MSC-Exo为心肌细胞提供了一个短时间窗口，使其有机会恢复功能障碍。急性心肌梗死由于心肌细胞再生不足而导致心力衰竭，因此，促进心肌细胞增殖是心功能恢复的关键。细胞周期的诱导和抑制心肌细胞增殖基因的下调可诱导心肌细胞重新进入增殖状态。MicroRNA谱分析显示，MSC外泌体治疗后心肌细胞中一组MicroRNA发生了显著变化[11]。Hsa-miR-590-3p能够下调抑制细胞增殖的基因如Hopx的表达，在心肌增殖中具有良好的应用前景。基于心肌肌钙蛋白(cTnI)在梗死区微环境中的高表达，Wang等[12]利用基因转染在间充质干细胞表面表达cTnI靶向短肽，获得cTnI靶向外泌体。这些外泌体可沿cTnI浓度梯度定位于梗死区。携带hsa-miR-590-3p的外泌体被心肌细胞内吞，从而促进心肌细胞在梗死周围区域的增殖，最终恢复心功能。此外，GATA结合蛋白4表达的骨髓间充质干细胞外泌体诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化，减少缺氧诱导的心肌细胞凋亡，改善梗死后心肌功能[13]。最新研究发现，Peng等[4]通过利用MSCs源性的外泌体miR-25-3p治疗心肌梗死，发现其是通过靶向促凋亡蛋白从而抑制心肌梗死。

3 间充质干细胞来源外泌体与血管再生

间充质干细胞通过分泌许多影响内皮细胞生长和血管再生的蛋白从而促进血管生成，包括血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子 (HGF)[14]。然而，有证据表明外泌体也介导了这一促血管生成机制的一部分[15]，Gong等[16]从MSC细胞系C3H10T1/2中分离出外泌体，发现外泌体在体外刺激内皮细胞增殖。Shabbir等[17]发现骨髓间充质干细胞外泌体在体外刺激内皮细胞的形成，促进成纤维细胞的增殖和迁移，另有研究[18]发现脂肪间充质干细胞来源的外泌体在I/R损伤时能保护皮瓣，诱导新生血管形成。最后，Hu等[19]证明MSC外泌体能够增强小鼠后肢缺血模型的微血管密度和血液灌注，通过超滤和密度梯度纯化从而诱导间充质干细胞分离出外泌体，并进一步证实其在体外刺激内皮细胞迁移、增殖和成管。关于间充质干细胞外泌体刺激血管生成的机制，很多研究都集中在其外泌体的miRNA上。Liang等[20]发现miR-125a在脂肪间充质干细胞外泌体中富集，并且通过抑制DLL4促进血管生成，Gong等[16]通过实验发现miR-30b在体外对刺激内皮细胞增殖具有重要作用，在裸鼠体内皮下注射的人脐静脉内皮细胞经miR-132外泌体预处理可显著提高其体内血管生成能力[21]，最近的研究[22]表明，MSC-Exo通过microRNA-126过表达，同时通过PI3K/Akt信号通路促进血管生成。Chen等[23]发现MSC-Exo通过miR-672对骨骼再生过程中的血管生成起正向调节作用。总的来说，刺激血管生成的促血管生成miRNA的特性可能取决于MSC的来源，并且很可能随着实验模型的不同而变化。然而分析培养细胞释放的外泌体中的miRNA相当困难，不仅因为其产量低，还因为血清或细胞培养中添加的其他物质中含有的miRNA可能相互影响[24]。

4 间充质干细胞来源外泌体与免疫调节

心血管疾病与免疫系统密切相关，淋巴细胞和单核巨噬细胞等参与了心血管疾病的发生和发展。间充质干细胞来源的外泌体可诱导受损组织的修复，并对不同淋巴细胞的分化、活化和功能发挥免疫调节作用，而骨髓间充质干细胞外泌体可能在免疫调节中发挥重要作用，它们抑制几种免疫细胞的增殖。在B淋巴细胞中，它们通过调控相关基因mRNA的差异表达来调节细胞功能[25]。有证据表明，AFSC条件培养基(不含外泌体)的主要作用是诱导淋巴细胞凋亡，而AFSC来源的外泌体会降低淋巴细胞的增殖[26]。人脐带间充质干细胞外泌体通过增加调节性T细胞的比例，降低辅助性T细胞17的比例，对体外T细胞具有免疫调节作用[27]。胎儿肝脏MSC衍生的外泌体能够抑制NK细胞的增殖、活化和细胞毒性[28]。研究[29]发现，MSCs发挥免疫调节的一种方式是释放脂质信号分子前列腺素E2，作为脂质，前列腺素被发现与外泌体的脂膜有关。然而，前列腺素E2是否参与间充质干细胞外泌体的免疫抑制机制尚未被研究。Sun等[30]通过小鼠腹腔注射阿霉素，建立扩张型心肌病模型，并静脉注射MSC-Exos，证明了MSC-Exos依赖于JAK2-STAT6通路介导巨噬细胞极化，MSC-Exos通过调节巨噬细胞的极化，改善扩张型心肌病的炎症微环境，有望为扩张型心肌病的临床治疗提供希望。另外Zhao[31]实验发现，MSC-Exo通过miR-182改变巨噬细胞活化状态，从而减轻小鼠心肌I/R损伤。

5 外泌体的吸收

外泌体吸收效率与细胞内微环境活性有关，这为缺血组织外泌体的聚集提供了一种机制，MSC外泌体优先被细胞内pH值较低的缺血心肌细胞内吞。尽管有明确证据表明未成熟心肌细胞能够吸收外泌体，但外泌体能够进入心肌细胞并将miRNA等物质传递给心肌细胞的具体机制尚不清楚。只有少数研究对此进行了实验，事实上，心肌细胞对外泌体的摄取相对较少[32-34]。体内心肌细胞摄取外泌体的证据更加有限，主要局限于基因表达改变的间接表现，这可能是由于miRNA的传递，但同样也可能是外泌体表面蛋白激活受体的反应。另一种可能是外泌体作用于内皮细胞 ,因为这些细胞可以吸收所有类型的外泌体，包括MSC外泌体。此外，在一些实验中，外泌体甚至可能不是直接作用于心肌，而是作用于巨噬细胞或单核细胞。

心血管疾病领域的外泌体研究尚处于起步阶段，迄今为止对此类问题的研究相对较少，这可能是由于缺乏相关知识或在研究外泌体方面存在技术困难所致。为了充分理解外泌体的装载、靶向和传递的生物学机制，以及为了确定外泌体中的内源性物质，需要进行更深入的研究。