人补体调节蛋白CD46与异种移植

容勋精 综述 王毅 审校

海南医学院第二附属医院器官移植科，海南 海口 570100

同种异体移植是治疗终末期器官功能衰竭疾病的较好医疗手段之一。同种异体肾移植的优点在临床上已经得到了充分的证实，相对于血液透析或者腹膜透析等治疗方式，同种异体肾移植不仅延长了患者的生存时间，而且明显改善患者的生活质量。然而，人体器官的供需不平衡使器官移植在临床应用上遇到瓶颈。在中国，每年需接受肾移植的患者大约30万，而实际接受肾移植的患者小于2 万，这使器官来源短缺的问题更加突出。异种移植以转基因猪器官移植的形式提供了克服已故和活着的人类捐赠者长期短缺的可能性，成为解决器官来源短缺这一世界性难题的根本途径之一。然而猪-非人灵长类动物的异种移植同样面临着许多障碍，其主要障碍除组织相容性差及异种排斥反应外，还有凝血功能障碍、炎症过程及人畜共患传染病等，这些最终会造成异种移植物的失功。面对这些障碍研究者们不仅可以敲除异种抗原，还可以转入人体补体调节蛋白(CRP)等进行调节，这使异种移植物的存活时间有所延长。人体CRP 主要包括人衰变加速因子、攻膜复合物抑制因子和膜辅助蛋白(CD46)等。本文将着重阐述人膜辅助蛋白(hCD46)在异种器官移植中的作用。

1 hCD46 的结构与功能

1.1 hCD46 的结构1985 年，hCD46 首次在人外周白细胞中发现，是能与C3b结合的膜蛋白，它被命名为gp45.70[1]。之后，有人首次提纯并明确gp45.70为C3b 及C4b 裂解的辅助因子，同时改其名为膜辅蛋白，并依据人白细胞分化抗原划分为CD46，因此CD46 又称膜辅助蛋白[2]。hCD46 其染色体定位于人类1 号染色体短臂的32 号区，其分子量大小约48～56 KU，含有4 个同源的的短序列(scr)，属于补体活化调节蛋白基因家族[3-4]。CD46 的N 端由4 个补体控制蛋白(CCPs)和一个通过选择性剪接产生的高度O-糖基化区域组成，包括B 和/或C 亚型。B 和C 结构域富含苏氨酸、丝氨酸和脯氨酸(STP)，随后是12个功能未知的氨基酸、一个跨膜区域，然后是两个可能的选择性剪接细胞质尾部(CYT-1或CYT-2)中的一个。这两个细胞质结构域都含有信号传递基序，并被证明介导不同的细胞功能[5-7]。CD46 为单链蛋白，通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定于细胞膜上，广泛表达于造血细胞、白细胞、上皮细胞、血小板和成纤维细胞等表面，但不表达于红细胞。

1.2 hCD46 的功能

1.2.1 CD46 与免疫调节CD46 是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，最初被鉴定为补体抑制剂。它是先天免疫系统的一部分，但也在适应性免疫中发挥作用。在先天免疫系统中，CD46是因子Ⅰ介导的C3b和C4b裂解的唯一普遍表达的辅助因子，在保护宿主细胞免受有害补体激活损伤中起到关键作用[8]。CD46 能够同时在经典和旁路途径两条途径中发挥调控补体激活的功能[9-10]。目前，关于CD46 在先天性免疫细胞中的作用了解甚少。有项研究表明CD46激活后可降低自然杀伤细胞的杀伤活性[11]。有关CD46 在适应性免疫系统中的研究相对较多，ASTIER 等[12]、ZAFFRAN 等[13]观察到CD46 可作为人类CD4+T 细胞的共刺激分子，在抗原提呈过程中激活CD46 可诱导细胞增殖。CD46 的两个主要细胞内尾(Cyt1 和Cyt2)通常在人细胞中共同表达。CD46的Cyt1和Cyt2对细胞增殖和白细胞介素2 (IL-2)和白细胞介素10 (IL-10)分泌量的控制不同，Cyt1可促进CD4+T细胞增殖，降低CD8+细胞毒性和IL-2 的产生，抑制炎症反应，而Cyt2 增加CD8+细胞毒性并降低IL-10 的产生，从而促进炎症反应，Cyt1 的分裂促进T 细胞的活化，而Cyt2 的分裂抑制T 细胞的活化[14-15]。之后的一系列研究最终证明在T 细胞活化过程中CD46 的参与可诱导IL-10 分泌及调节性T 细胞(Tregs)的激活或生成[16-18]。而调节性T细胞对于维持外周免疫耐受和免疫反应的控制起到非常重要，可抑制和控制效应物辅助型T 细胞1(Th1)、辅助型T细胞2 (Th2)和辅助型T细胞17 (Th17)的激活，IL-10则是一种有效的免疫抑制细胞因子，其在自身免疫性脑脊髓炎(EAE)和小鼠多发性硬化(MS)模型中的重要性已得到充分证明[19-21]。总之，CD46在适应性免疫系统中起到促进T 细胞活化[12]、调节炎症[15]和1型调节性T细胞(Tr1)分化[17]，以及影响T细胞形态[13]和极性[11]的作用。虽然目前没有迹象表明CD46介导的信号直接影响B细胞增殖、存活或抗体产生[22]，但已有研究表明CD46激活的T细胞对B细胞的影响，CD46可通过与调节性T细胞接触及IL-10的产生来促进B细胞产生抗体[22]。

1.2.2 病原体磁铁CD46 是某些病原体的受体。CD46广泛表达于各类细胞及相对较高水平的表达模式很好的解释了某些病原体可利用CD46作为受体的原因。这些病原体可能利用CD46作为一个或多个补体调节活动、信号传递能力或内在化机制[23]。目前发现9种人类特异性病原体以CD46为受体，分别包括4种病毒(麻疹病毒、B、D组腺病毒和6型疱疹病毒)和5 种细菌(淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、化脓性链球菌、大肠埃希菌和核梭杆菌)。其中研究最广泛的是麻疹病毒和CD46之间的相互作用[6，24]。麻疹病毒血凝素附着在CD46结构中的ccps1和ccps2上，引起细胞内部化，改变细胞内处理和抗原呈递[25-26]。麻疹病毒与CD46结合增加了小鼠巨噬细胞一氧化氮的产生[27]，降低了人巨噬细胞中IL-12的产生[28]，以及改变了非淋巴细胞细胞系中CD46的内化途径[29]。此外，麻疹病毒的附着可诱导CD46转换，从而增强细胞对补体介导的溶解的敏感性[30-31]。腺病毒纤维结蛋白同样附着在CD46结构中的ccps1和ccps2上，而疱疹病毒6型的包膜糖蛋白复合物结合ccps 2和ccps 3[32]。奈瑟菌属的Ⅳ型菌毛主要针对CD46 结构的ccps3 和ccps4 以及STP 片段。奈瑟菌与CD46相互作用产生钙通量和CYT-2的酪氨酸磷酸化[33-34]。研究表明，这种磷酸化对奈瑟菌附着和细胞骨架重排至关重要，并且奈瑟菌在感染期间也刺激CD46尾部的蛋白水解裂解[9，35]。总的来说病原体与CD46的结合可通过诱导CD46下调和补体攻击敏感性来触发炎症反应，从而帮助宿主防御[31]、炎症细胞因子的产生[36]、抗体类别转换[37]和自噬[38]。

1.2.3 CD46 与人类自身免疫性疾病补体的激活对病原体具有毁灭性，但同时也可以对自身组织造成类似的损害。补体调节蛋白CD46特性研究揭示了补体和适应性免疫之间的新的和意想不到的联系，及补体在感染和自身免疫疾病中的作用。CD46变异与炎症性疾病的关系日益密切，尤其是以小血管血栓形成为特征的炎症性疾病，特别是非典型溶血性尿毒综合征(aHUS)[39-43]。CD46基因突变，内皮细胞特异性补体调节缺陷，造成aHUS，表现为溶血性贫血、血小板减少症和急性肾功能衰竭等症状[44-45]。多发性硬化是由于脑和脊髓轴突脱髓鞘导致认知障碍的慢性自身免疫性疾病，而T细胞是诱导慢性炎症、脱髓鞘和轴突损伤的中心角色[46]。1型调节性T细胞(Tr1)是Treg的一个亚群，其特征是分泌IL-10，这是一种有效的抗炎分子。事实上，CD46有能力根据细胞因子环境将T细胞表型从Th1 转换为Tr1[18]。多发性硬化症(MS)患者的Tr1分化途径存在缺陷，因为约50%的患者在CD46激活后产生IL-10[47-48]。另一项有趣的研究表明，与健康献血者相比，多发性硬化症患者的树突状细胞在CD46激活后产生的促炎性细胞因子IL-23p19的数量也可能增加。这增加了IL-23 的产生，然后反过来又诱导T 细胞增加IL-17 的产生[49]。类风湿性关节炎主要导致关节软骨破坏和关节强直的慢性全身性疾病，自动反应效应T细胞调节缺陷，使T细胞在CD46激活后不会“关闭”伽马干扰素(IFN-g)，因此缺乏IL-10+细胞亚群，产生的IFN-g 比健康人的T 细胞多20 倍。此外，类风湿关节炎患者的IFN-g+/IL-10+T细胞群是非抑制性的，而来自健康献血者的IFN-g+/IL-10+T细胞群抑制旁观者T细胞激活[18]。CD46介导的Tr1分化缺陷不仅存在于MS和类风湿关节炎[18]中，在哮喘[50]的患者中也存在。哮喘以气道阻塞和支气管痉挛为特征的气道慢性炎症性疾病，缺陷效应T 细胞调节：IL-10生成减少[50]。有趣的是，联合使用地塞米松和CD46共同刺激哮喘患者的T 细胞，可使IL-10 的产生恢复到正常水平，这表明CD46 和糖皮质激素受体通路之间存在功能性串扰[50]。原发性C3 缺乏症为由于重要免疫细胞功能受损而导致的反复和严重感染，C3 基因突变缺少的效应T 细胞诱导和调节，CD46 激活后不产生IL-10和减少IFN-g的产生[51]。除上述疾病外，CD46也与免疫调节性多内分泌疾病肠病X连锁综合征相关[52]。

2 hCD46与异种移植物

2.1 hCD46 与心脏移植DIAMOND 等[53]将表达hCD46的猪心脏异位移植到狒狒体内，发现避免了超急性排斥反应(HAR)，心脏存活了23 d。这是首次证明hCD46 在转基因猪器官中的表达可以保护猪器官免受异种环境中补体激活介导的损伤，同时发现在转基因猪器官上表达hCD46 可阻止补体的激活。转基因猪心脏病理没有检测到C5b 沉积，也没有检测到的膜攻击复合物(MAC)沉积。ADAMS 等[54]在猪-狒狒心脏异种移植中发现与野生型心脏相比，表达hCD46 的心脏具有更长的存活时间和更少的补体沉积。而且与超急性排斥的野生型心脏相比，表达hCD46 的心脏的组织学显示MAC 沉积减少。表明hCD46蛋白在猪-灵长类异位心脏移植模型中对超急性排斥具有保护作用。在兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白(ATG)和利妥昔单抗诱导，移植前脾切除及术后应用免疫抑制剂的基础上表达hCD46 的异种心脏移植最高存活了137 d[55]。然而，以抗胸腺细胞球蛋白和aCD20 抗体诱导，用霉酚酸酯和密集剂量的aCD40(2C10R4)抗体维持的GGTA1KO.hCD46.hTBM 猪-灵长类异种心脏移植存活达到945 d[56]。

2.2 hCD46 与肺移植通过基因修饰，异种心脏、肾脏和肝脏的超急性排斥反应和早期移植失败的发生率显著降低[57-58]。相比之下，表达人源C 反应蛋白(hCRP)或GGTA1基因敲除(GGTA1KO)的猪肺异种移植在人血或猪-狒模型的体外灌注中仍然容易发生超急性肺排斥反应(HALR)[59-60]。体外实验证明，hCRP 的额外表达通过抑制补体级联激活，进一步增强了对异种细胞损伤的保护[61]。WESTALLG 等[62]的研究表明，表达多种基因修饰(hCD55、hCD59) 的GalTKO肺在异种灌注模型中表现出改善和持续的肺功能。Burdorf和Pierson使用hCD46/ GGTA1KO猪肺移植对狒狒进行了维持生命的肺移植。hCD46 的加入对延长移植物存活时间几乎没有影响，平均存活时间的中位数为240 min，范围为0～240 min。然而，BURDORF 等[63]发现与GGTA1KO 肺相比，hCD46/GGTA1KO 肺中位生存时间更长(hCD46/GGTA1KO为171 min，GGTA1KO 为120 min)。而且除了补体激活的显著下调外，在GGTA1KO 肺中hCD46 的表达降低了血小板和凝血级联激活、中性粒细胞隔离和组胺释放[63]。对于hCD46 在异种移植肺的作用，仍需进一步研究。

2.3 hCD46 与肝移植与异种心脏或肾脏移植相比，猪肝异种移植似乎更令人困惑，尽管已经取得了很大进展。关于异种移植肝的研究较少，而对于hCD46 在异种肝移植的研究更少。在异种肝移植研究中反复出现的障碍是因为血小板减少症的迅速发展，并伴有出血并发症和凝血障碍。然而由于主要的问题未解决，特别是凝血失调，猪肝异种移植存活率仅限于一个月[64-65]，尤其是血小板大量丢失会导致致命出血[66-67]。目前GGTA1KO 肝异种移植存活时间最长为29 d[67]，而在GGTA1KO 的基础上表达的hCD46存活了4～7 d[68]。

2.4 hCD46 与胰岛移植通过移植替代受损的器官或组织是改善危及生命的疾病的理想方法。对于Ⅰ型糖尿病患者来说，进行胰岛移植是较好的医学治疗之一，但同样面临着器官资源短缺的困难，而异种胰岛移植是解决胰岛器官来源短缺的一种潜在方法。事实上，临床前的模型已经证明猪胰岛可以在糖尿病非人灵长类动物中移植、存活并实现葡萄糖稳态[69-72]。在猪-非人灵长类动物的胰腺移植中最大的障碍是灵长类动物对猪胰岛的免疫及炎症反应，可能表现为快速早期移植物排斥反应(即血液介导的即时炎症反应)或T细胞介导的排斥反应。猪胰岛移植成功地逆转了非人灵长类动物的糖尿病至少100 d[73-74]。然而，通过在猪胰岛上表达hCD46 抑制补体激活并不能显著减少胰岛质量的初始损失，而是有效地限制抗体介导的排斥反应。这导致对免疫抑制的需求减少，以保持足够的胰岛质量来长期维持正常血糖[75]。

2.5 hCD46与肾移植CD46作为CRP家族的一员，它是血浆丝氨酸蛋白酶因子Ⅰ介导的C3 和C5 转化酶亚基C4b和C3b的辅助因子。在本质上，CD46在保护细胞免受补体介导的经典和替代途径的裂解方面都非常有效[10，76]。VAKNIN-DEMBINSK等[49]首次在活体内证明了表达在猪器官上的人CD46能够调节补体激活和克服移植到非人灵长类动物体内的超急性排斥反应的能力。有研究表明尽管存在抗体和补体沉积，单个CD46 转基因可控制未经治疗的狒狒超急性肾移植排斥反应[18]。而在GGTA1KO/hCD46猪在狒狒体内的肾脏移植，总是伴随着消耗性凝血病的早期发展，所有接受者都在16 d 内实施安乐死[77]。非人类灵长类动物(NHP)的猪肾移植存活率最近显著提高[78]。在2015年之前，猪肾移植在NHP中的最长存活时间是90 d[79]。在2015 年，ADAMS 等[80]实施一例GGTA1KO/hCD46/hCD55/hTBM/hEPCR/hCD39 猪到狒狒的异种肾移植，移植物存活136 d，肾功能良好，肌酐值正常，未出现明显的排斥症状。2019 年，KIM等[81]进行GGTA1KO/hCD55 猪至猕猴异种肾移植，创造了499 d的世界最长生存纪录。

3 总结

CD46 是人体补体调节蛋白的一员，是一把双刃剑。CD46可以在先天性免疫及适应性免疫中起到免疫作用，但也能作为一些病原菌的受体引发疾病的发生。它对病原体具有毁灭性，也可对自身组织造成类似的损害。转基因猪的器官虽是可以解决器官资源短缺的潜在方法，但也面对着异种抗原导致的排斥反应、组织相容性差、凝血功能絮乱、炎症等问题。hCD46是多基因修饰中的一个，在一定程度上起到增强组织相容性、减轻凝血功能絮乱、抑制炎症等作用。目前hCD46在异种心脏移植的效果较好，而在异种肝、肾、胰岛移植的效果差一些，但在异种移植中起到了一定作用。hCD46 的生化结构本身就是一个复杂调节的来源，产生了许多亚型，其表达受到不同信号的密切调节，如凋亡和细胞激活。在功能上，CD46不仅根据其环境微调T 细胞反应，而且通过其对表达和酶处理的严格调节，具有启动和随后终止T 细胞反应的能力。hCD46 的复杂性要使其在异种移植中发挥更好的作用，还需要一定的科学研究。