白花蛇舌草多糖提取物对喉癌Hep-2细胞内质网自噬的影响*

张岩岩， 刘 华， 宋 扬， 郭海艳

(唐山市工人医院耳鼻喉科， 河北 唐山 063000)

喉癌发生率约占头颈部肿瘤的20%，也是头颈部继鼻咽癌之后第二大类恶性肿瘤，严重威胁着患者生命安全，降低生活质量[1，2]。喉癌起病隐匿，不易发现，部分患者发现时已是中晚期，手术治疗效果不佳，但化疗药物治疗肿瘤的同时，人体正常器官亦受到极大损害，因此，研发或探索新型抗肿瘤药物已成为目前的研究热点。中药作为我国特有的卫生资源，具有巨大的原创优势及发掘潜力，白花蛇舌草出自《广西中药志》，具有“清热解毒、消痛散结、利尿除湿”的功效，在其他少数民族的医药典籍中亦有记载，其中景颇族的《德宏药录》、基诺族的《基诺药》均记载其除了清热解毒功效外，亦有抗肿瘤作用。现代药理学证实[3]，白花蛇舌草多糖提取物(hedyotis diffusa polysaccharide extract，HDPE)可促进喉癌Hep-2细胞凋亡，并抑制其增殖能力，但并未进行深入研究。

内质网应激本身为真核细胞为应对内质网中Ca2+紊乱及未折叠蛋白内质网蓄积的一种自我保护机制，但高强度而持续的内质网应激易引发细胞凋亡，已成为线粒体细胞凋亡通路后又一重要的凋亡相关机制[4]。内质网自噬多由内质网应激所激活，与内质网应激共同参与处理未折叠蛋白，缓解严重的内质网应激，从而维持内质网稳态，避免细胞凋亡[5]。本研究拟培养喉癌Hep-2细胞，并使用不同浓度HDP进行干预，观察细胞内质网应激、内质网自噬发生情况及增殖能力变化。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料、试药和仪器

Hep-2细胞株由购自于美国 ATCC公司。HDPE购自南京泽朗医药科技有限公司，批号A20190213，纯度≥98%；自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)购自美国Sigma公司，批号：M9281；噻唑蓝(MTT)检测试剂盒购自苏州宇恒生物有限公司，货号C5236；原位末端转移酶标记(TUNEL)试剂盒购自上海碧云天公司，货号C1088；anti-Beclin-1、anti-LC3Ⅰ、anti-LC3Ⅱ、anti-GRP78、anti-ATF6及anti-CHOP(英国Abcam公司，货号分别为ab62557、ab627214、ab48394、ab108615、ab203119、ab179823)；山羊抗兔/鼠过氧化物酶二抗(北京康为世纪公司，货号CW1222)。BX53型荧光显微镜购自日本Olympus公司；muLISKAN-MK3酶标仪购自美国Thermo公司；5804R型高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司；MCO-18AC型细胞培养箱购自日本Sanyo公司；WD-9413B型凝胶成像系统购自北京六一生物科技有限公司；SD Cell 型转移电泳槽购自美国Bio-rad公司。

1.2 细胞培养与分组

将Hep-2细胞调整约为4×103cells/well接种于12孔板内，细胞培养液为DMEM+10%FBS溶液，37℃、5% CO2培养条件下于培养箱中，待生长至 80%时，加入PBS 溶液清洗细胞，添加0.2%胰酶消化，进行传代培养，当细胞培养至第 3 代时可用于后续研究。将培养48 h细胞弃掉上清培养液，分为对照组、HDPE 100、200、400 mg/L组和3-MA组，分别加入HDPE 0、100、200、400 mg/L[3]和3-MA 20 μmol/L溶液[6]，培养48 h。

1.3 细胞增殖抑制率检测

采用噻唑盐比色法(MTT)检测各组细胞增殖抑制率；首先用台盼蓝拒染法确认Hep-2细胞拒染率在95%以上；常温下收集细胞，并调整细胞混悬液浓度至1×106cells/ml，以每孔200 μl细胞混悬液接种于96 孔板中，生长至>50%融合度时加入含终浓度为0、100、200、400 mg/L HDPE，及20 μmol/L 3-MA，每组5个复孔，培养24、48及72 h，结束后加入MTT溶液20 μl(5 g/L)，充分反应4 h后弃上清，每孔再加入DMSO溶液200 μl，读取吸光度(A)波长为570 nm。

增殖抑制率%=(1-A实验组/A对照组)×100%。

1.4 荧光TUNEL染色

各组培养48 h细胞加入12孔板，经过0.1% Trition X-100透化，加入3% H2O2200 μl，PBS漂洗3次后，加入蛋白酶K灭活DNA、RNA，最后加入TUNEL液，恒温箱中避光孵育60 min。取出后经PBS冲洗3次加入DAPI反应液，反应20 min后冲洗封片。应用荧光显微镜观察细胞，绿色代表已凋亡细胞，蓝色代表仍生存细胞。

凋亡指数(AI)=各视野阳性细胞数/视野所有细胞总数×100%。

1.5 单丹黄酰尸胺(MDC)染色观察自噬溶酶体情况

配置含MDC的DMSO储存液，浓度为5 mmol/L，将各组培养48 h的Hep-2细胞重悬于6孔板内(细胞密度1×106cells/ml)，加入50 μmol/L MDC溶液，细胞孵育箱内培育45 min，培育条件为37℃、5% CO2，后收集细胞；经PBS溶液洗涤2次后，再用60 μl PBS溶液重悬，取液滴片，经紫外光激发，绿色荧光为细胞自噬囊泡，用倒置荧光显微镜在相同曝光条件下随机选取 3 个视野进行拍照，观察自噬空泡的变化情况并摄片，Image J软件计算荧光度。

1.6 透射电镜检测自噬发生情况

选取各组培养48 h细胞，细胞密度调定1×105cells/ml，无菌操作下置于6孔板中，500 μl/well，使用含 EDTA的胰酶消化细胞，加入4%戊二醛固定细胞，将固定细胞逐级乙醇脱水，用 70%乙醇醋酸双氧铀块染色，包埋、切片后用透射电子显微镜观察Hep-2细胞中内质网中自噬囊泡形成情况。

1.7 Western blot法检测内质网凋亡及内质网自噬蛋白

取不同组别培养48 h 的Hep-2细胞，BCA法测定各组蛋白浓度，制备上样液。取各组待测样品15 μl和5 μl蛋白Marker，加入电泳装置中，待电泳结束后进行免疫印迹，转膜，封闭，加入Beclin-1蛋白(Beclin-1)、微管相关轻链蛋白3Ⅰ(light chain 3Ⅰ，LC3Ⅰ)、LC3Ⅱ、葡萄糖调节蛋白 78(glucose regulatory protein 78，GRP78)、活化转录因子6(activated transcription factor 6，ATF6)及CCAAT 增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT enhancer binding homologous protein，CHOP)对应一抗(一抗比例均为1∶800)，4℃孵育过夜，PBS洗膜2次后加入二抗(1∶500)，常温下孵育2 h，PBS洗膜3次，ECL显像，暗室曝光，扫描胶片，用凝胶图像处理系统分析。

目的蛋白的相对表达量=目的蛋白的灰度值/β-actin的灰度值。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 各组细胞增殖抑制率检测

与对照组比较，HDPE 100、200、400 mg/L组和3-MA组细胞在培养24、48、72 h后增殖抑制率升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与3-MA组比较，HDPE 400 mg/L组培养24、48、72 h后增殖抑制率升高，差异有统计学意义(P<0.05, 表1)。

Tab. 1 Effects of HDPE on proliferation inhibition rate of Hep-2 n=6)

2.2 各组细胞TUNEL染色凋亡情况

TUNEL染色下正常细胞核为蓝色荧光，凋亡细胞核为绿色荧光。TUNEL染色结果显示：对照组细胞基本为蓝色荧光，HDPE100、200、400 mg/L组及3-MA组细胞绿色荧光细胞核逐渐增多(图1)。与对照组(AI=2.46±0.24)比较，HDPE 100、200、400 mg/L组(AI=7.62±1.33；AI=12.85±2.05；AI= 31.28±4.62)及3-MA组(AI=17.59±2.75)细胞凋亡数量增多，差异有统计学意义(P<0.05)。与3-MA组比较，HDPE 400 mg/L组细胞凋亡数量增多，差异有统计学意义(P<0.05)。

Fig. 1 Effects of HDPE on apoptosis of Hep-2 cells (TUNEL staining × 200)

2.3 各组细胞自噬溶酶体荧光强度情况

与对照组[(38.47±4.35)%]比较，HDPE 100、200、400 mg/L组[(26.72±2.18)%、(16.85± 2.04)%、(8.43±1.34)%]及3-MA组[(13.67± 3.75)%]荧光强度均降低，差异有统计学意义(P< 0.05)；与3-MA组比较，HDPE 400 mg/L组荧光强度降低，差异有统计学意义(P<0.05, 图2)。

Fig. 2 Effects of HDPE on autophagy lysosomes in Hep-2 cells (MDC staining × 400)

2.4 透射电子显微镜观察内质网自噬发生情况

对照组细胞透射电子显微镜下内质网周围自噬囊泡出现较多，HDPE 100、200、400 mg/L组及3-MA组内质网周围自噬囊泡出现明显减少；与3-MA组比较，HDPE 400 mg/L组内质网周围自噬囊泡形成减少(图3)。

2.5 各组细胞内质网凋亡及内质网自噬蛋白表达情况

与对照组比较，HDPE 100、200、400 mg/L组及3-MA组细胞GRP78、ATF6、CHOP表达及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值升高，Beclin-1表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与3-MA组比较，HDPE 400 mg/L组GRP78、ATF6及CHOP表达及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值升高，Beclin-1表达降低，差异有统计学意义(P<0.05，图4，表2)。

Fig. 3 Effects of HDPE on the formation of autophagy vesicles around endoplasmic reticulum in Hep-2 cells (×2500)

Fig. 4 Effects of HDPE on GRP78, ATF6, CHOP, LC3 Ⅰ, LC3II and Beclin-1 proteins in Hep-2 cells

Tab. 2 Effect of HDPE on the expressions of GRP78, ATF6, CHOP, Beclin-1 protein and LC3Ⅰ/LC3II in Hep-2 cells (n=5)

3 讨论

中药是我国独特且宝贵的医疗资源，是中医长期临床实践，反复印证得到的宝贵经验，但既往在长期的临床应用中，仅能探索其临床功效，对其具体药物作用靶点的研究仍需不断探索。白花蛇舌草最早记载于《神农本草经》，用于治疗疔疮肿毒，毒蛇咬伤，其经乙醇分离后鉴定芦丁、槲皮素、山奈酚是白花蛇舌草黄酮类的主要成分，均具较强的DNA裂解能力，抑制肿瘤细胞增殖[7，8]。在现代的中药药理研究中证实，白花蛇舌草具有抗肿瘤、炎症、清除氧化自由基等作用[9-11]。喉癌近些年来发病率不断上升，虽然经常规手术及放化疗治疗后5年生存率可达68.2%，但仍不能满足临床工作者及患者的心理期望[12]。本研究采用HDPE对喉癌Hep-2细胞进行培养，并且应用自噬抑制剂3-MA为阳性对照药物，MTT实验结果证实HDPE可有效升高Hep-2细胞增殖抑制率，说明HDPE可抑制喉癌Hep-2细胞生长。

内质网是真核细胞最大的膜系统，不仅调控离子平衡、蛋白合成、脂质合成、膜生成，更可激活凋亡通路，导致细胞程序性死亡[13]。肿瘤细胞由于其疯狂生长的特性，导致细胞长期处于缺血缺氧状态，易处于内质网应激状态，激活泛素化及内质网自噬处理内质网中未折叠或错误折叠蛋白，以保证肿瘤细胞继续存活、增殖[14]。内质网自噬可选择性清除细胞内受损的内质网或内质网片段，从而起到改善细胞内环境，保护细胞的作用。已有研究发现[15]，抑制肿瘤细胞内质网自噬，减少未折叠蛋白降解，可加重内质网应激程度，高强度而持续的内质网应激诱导肿瘤细胞启动凋亡程序，进而起到降低肿瘤细胞增殖能力的作用。本研究首先通过MDC染色，发现不同剂量HDPE组及3-MA组细胞自噬空泡荧光度较对照组细胞荧光度降低，说明喉癌Hep-2细胞本身自噬程度较强，经HDPE干预后可抑制Hep-2细胞自噬。通过透射电子显微镜观察各组细胞发现，常规培养Hep-2细胞内质网内及内质网周围出现较多自噬囊泡及自噬小体，而经不同剂量HDPE组及3-MA组细胞内质网内及内质网周围自噬囊泡及自噬小体均减少。结合MTT实验结果，说明HDPE可能通过抑制内质网自噬起到抑制Hep-2细胞增殖作用。

为了进一步确认HDPE对Hep-2细胞内质网应激及内质网自噬的影响，本研究对GRP78/ATF6/CHOP内质网应激凋亡信号通路及自噬标记蛋白Beclin-1、LC3Ⅰ及LC3Ⅱ进行检测。GRP78是内质网特异性的分子伴侣蛋白，其表达程度可直接反应内质网应激程度，也是对抗内质网应激的保护性反应[16，17]。ATF6是内质网Ⅱ型跨膜蛋白，其N端位于细胞质内，C端位于内质网中，可感受内质网应激并活化CHOP，诱导细胞凋亡[18]。Beclin-1及LC3Ⅰ/ LC3Ⅱ比值已被公认为自噬标记蛋白，均可在分子层面反应细胞自噬发生与否[19，20]。本研究证实，经HDPE及3-MA干预后，Hep-2细胞GRP78、ATF6、CHOP表达及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值升高，Beclin-1表达降低。说明Hep-2细胞中内质网应激与内质网自噬同时发生，共同降解错误折叠蛋白或未折叠蛋白，维持细胞生殖能力。而HDPE可能通过抑制Hep-2细胞内质网自噬，降低肿瘤细胞处理未折叠蛋白能力，增强内质网应激反应，引发细胞凋亡，从而起到抑制细胞增殖作用，这也与MTT、MDC染色及透射电镜观察结果相一致。

综上所述，HDPE可能通过抑制Hep-2细胞内质网自噬反应，增强细胞内质网应激凋亡信号通路的敏感性，从而降低Hep-2细胞增殖能力，起到抑制肿瘤增殖作用。而自噬普遍存在于多种肿瘤中，抑制自噬可在一定程度上抑制肿瘤细胞增殖，本研究结果也可为其他肿瘤治疗提供思路。