机会性感染病原体对新发艾滋病患者抗病毒治疗过程中T 淋巴细胞亚群分布影响的队列研究

黄 山，吕松琴，段洪芬，施金丽，李光敏，黄 岗，李佳能，李晓非

（昆明市第三人民医院，云南省传染性疾病临床医学中心，云南 昆明 650041）

高效抗逆转录病毒治疗（highly active antiretroviral therapy，HAART）能有效抑制HIV 复制并减少病毒变异[1]，进而重建或者改善艾滋病患者免疫功能，绝大多数患者经 HAART 后，免疫功能恢复正常或接近正常水平[2]，但不规范的治疗[3]、个体差异[4]以及患者依从性[5]等因素，也会导致治疗失败。本文探讨新发艾滋病患者高效抗逆转录病毒治疗过程中外周血T 淋巴细胞亚群分布，通过队列研究旨在观察机会性感染的病原体是否对抗病毒治疗过程中的患者T 淋巴细胞亚群分布产生影响，为艾滋病的防治提供一些数据支持。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2019 年1 月1 日至2020 年6 月30 日昆明市第三人民医院感染一科收治的初次确诊[6]且未经抗病毒治疗的艾滋病患者220 例，随访1 a无失访病例，其中男性158 名，女性62 名，年龄（43.24±12.11）岁，依据《中国艾滋病诊疗指南（2018 版）》[7]经临床诊断，220 例中艾滋病合并结核分枝杆菌33 例，艾滋病合并丙型肝炎病毒30 例，艾滋病合并马尔尼菲篮状菌31 例，其余病例中艾滋病合并1 种病原体45 例，艾滋病合并2 种病原体30 例，艾滋病合并3 种及以上病原体51 例，治疗方案为富马酸替诺福韦二吡呋酯片+拉米夫定+依非韦伦（TDF+3TC+EFV），分别于治疗前、治疗3、6、12 个月采集患者抗凝血样本，采用流式细胞术检测患者外周血T 淋巴细胞亚群。本研究经昆明市第三人民医院伦理委员会审核通过，临床试验严格遵循赫尔辛基宣言和中国有关临床试验研究规范、法规进行。

1.2 主要仪器与试剂

单克隆荧光抗体CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC5、溶血素OptiLyse C、FlowCount 计数微球、Lymphosure 质控品、稀释液、Flow-Check Fluorospheres 流式细胞仪光路与流路校准物、BECKMAN Navios™ Flow Cytometer 流式细胞仪均购自美国Beckman Coulter 公司。

1.3 方法

流式细胞术检测外周血T 淋巴细胞亚群。患者空腹于早上7:00～9:00 用EDTA-K2 抗凝管行无菌穿刺术采集静脉血4 mL，24 h 内检测。取流式试管，用反向加样法加入100 µL 抗凝全血；加入相对应的四色抗体10 µL，涡旋混匀，室温避光放置15～20 min；取出试管，每管加入500 µL OpitiLyse C，涡旋混匀，室温避光放置10 min；取出试管，每管加入500 Μl PBS，室温平衡5 min；取出Flow-Count 荧光微球，涡旋震荡混匀10～12 s；以反向加样法在试管中加入100 µL 荧光微球；充分涡旋混匀，2 h 内上机检测。每次开机用Flow-Check Fluorospheres 对流式细胞仪进行光路与流路校准，记录前向散射光（FS）和各荧光信号的半峰变异系数（HPCV）值，追踪一定时间内HPCV 的变化，要求变异系数（CV）值控制在2%～3%，以确保仪器处于稳定状态，保证实验的一致性和稳定性。每天用Lymphosure 质控品进行一次室内质控，操作与样本相同，以保证检测结果的可靠性。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 艾滋病合并机会性感染病原体患者抗病毒治疗过程中T 淋巴细胞亚群分布特征

艾滋病合并结核分枝杆菌（以下简称“AIDS/TB”）、艾滋病合并丙型肝炎病毒（以下简称“AIDS/HCV”）和艾滋病合并马尔尼菲篮状菌（以下简称“AIDS/TM”）3 组患者T 淋巴细胞亚群检测数据经单样本Kolmogorov-Smirnov检验存在非正态分布数据（P<0.001），采用Kruskal Wallis检验比较分析，结果显示，3 组患者在治疗3 个月后CD3+、CD8+和CD4+T 淋巴细胞计数都明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），除了AIDS/TM 组治疗6 个月后CD4+T 淋巴细胞计数再次明显升高，其余2 组3 项指标随后治疗过程中无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。治疗1 后3 组患者的CD3+和CD8+T 淋巴细胞计数差异无统计学意义（P>0.05）；而AIDS/HCV 组CD4+T 淋巴细胞计数要高于其它2 个组，差异有统计学意义（P<0.05）。治疗过程中3 组患者的CD3+/淋巴细胞和CD8+/淋巴细胞百分比无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）；而AIDS/TB 和AIDS/TM 组CD4+/淋巴细胞百分比在治疗3 个月后明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；同时3 组患者1 的治疗过程中CD4+/CD8+比值都 <1（表1、图1。）

表1 AIDS/TB、AIDS/HCV、AIDS/TM 三组患者抗病毒治疗过程中T 淋巴细胞亚群分布特征[（，M（P25，P75）]Tab.1 The distribution characteristics of T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients in 3groups during antiviral therapy [，M（P25，P75）]

表1 AIDS/TB、AIDS/HCV、AIDS/TM 三组患者抗病毒治疗过程中T 淋巴细胞亚群分布特征[（，M（P25，P75）]Tab.1 The distribution characteristics of T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients in 3groups during antiviral therapy [，M（P25，P75）]

备注：AIDS/TB 33例；AIDS/HCV 30例；AIDS/TM 31例。

2.2 艾滋病合并感染单个及多种病原体患者抗病毒治疗过程中T 淋巴细胞亚群分布特征

艾滋病合并 1 种病原体（以下简称“AIDS/1”）、艾滋病合并2 种病原体（以下简称“AIDS/2”）和艾滋病合并3 种及以上（以下简称“AIDS/≥3”），3 组患者T 淋巴细胞亚群检测数据经单样本Kolmogorov-Smirnov检验也存在非正态分布数据（P<0.001），采用Kruskal Wallis检验比较分析，结果显示AIDS/1 组抗病毒治疗3 个月后CD3+和CD8+T 淋巴细胞计数明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），整个治疗过程中CD4+T 淋巴细胞计数无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）；AIDS/2 组治疗6 个月后CD3+及治疗3 个月后CD8+T 淋巴细胞计数明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；AIDS/≥3 组治疗6 个月后，CD3+和CD8+T 淋巴细胞计数才明显升高；AIDS/2和AIDS/≥3 组在治疗3、6 个月后CD4+T 淋巴细胞计数明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。治疗1 a 后3 组患者的CD3+和CD8+T 淋巴细胞计数无明显差异，差异无统计学意义（P>0.05）；而AIDS/1 组CD4+T 淋巴细胞计数要高于其它2 个组，差异有统计学意义（P<0.05）。治疗过程中3 组患者的CD3+/淋巴细胞和CD8+/淋巴细胞百分比无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）；而AIDS/≥3 组CD4+/淋巴细胞百分比在治疗3 个月后明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；同时3 组患者1 a 的治疗过程中CD4+/CD8+比值都 <1（表2、图2）。

图2 AIDS/1、AIDS/2、AIDS/≥3 三组患者T 淋巴细胞分布特征比较分析Fig.2 Comparative analysis the distribution characteristics of T lymphocyte with 3groups

表2 AIDS/1、AIDS/2、AIDS/≥3 三组患者抗病毒治疗过程中T 淋巴细胞亚群分布特征[，M（P25，P75）]Tab.2 the distribution characteristics of T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients in 3groups during antiviral therapy[，M（P25，P75）]

表2 AIDS/1、AIDS/2、AIDS/≥3 三组患者抗病毒治疗过程中T 淋巴细胞亚群分布特征[，M（P25，P75）]Tab.2 the distribution characteristics of T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients in 3groups during antiviral therapy[，M（P25，P75）]

备注：AIDS/1 45例；AIDS/2 30例；AIDS/≥3 51例。

3 讨论

HAART 的出现提高了艾滋病患者生存年限的同时也改善了患者的生活质量，使得艾滋病重新被定义为一种像高血压、糖尿病需终身服药的慢性病[8]，但查阅国家统计局数据[9]，近年艾滋病死亡人数及死亡率在甲乙类法定报告传染病中仍高居榜首，其中不规范的抗病毒治疗，患者依从性及HIV 耐药[10]等因素是造成患者死亡的主要原因，及早的发现、规范的治疗是HARRT 成功与否的关键[11]。

在HAART 过程中T 淋巴细胞亚群的检测尤其是CD4+T 淋巴细胞计数是判断患者疾病进展[12]、制定临床用药方案[13]、评价治疗效果和预后[14]的重要指标。基于笔者前期的研究基础[15]，本文对云南地区艾滋病机会性感染病原体中细菌占比第一的艾滋病合并结核分枝杆菌、病毒占比第一的艾滋病合并丙型肝炎病毒、真菌占比第三的艾滋病合并马尔尼菲篮状菌及感染不同数量病原体患者在HAART 过程中的T 淋巴细胞亚群分布进行了分析发现，抗病毒治疗初期由于体内机会性感染病原体的存在细胞特异性免疫响应更为快速，CD8+T 淋巴细胞计数明显上升，而且不论患者CD3+和CD8+T 淋巴细胞计数处于何种水平，经过规范的治疗后，两项指标都能恢复到同等水平与机会性感染病原的种类和感染数量无关。而艾滋病患者治疗前T 淋巴细胞亚群分布水平的高低和机会性感染病原体的种类及数量会影响治疗过程中CD4+T 淋巴细胞计数的恢复速度和水平，艾滋病合并马尔尼菲篮状菌和艾滋病合并2 种、合并3 种及以上病原体的患者CD4+T 淋巴细胞计数在治疗3 和6 个月后都出现了明显的升高，但治疗1 a 后CD4+T 淋巴细胞计数仅为200 个/µL 左右。新发艾滋病患者的T 淋巴细胞亚群分布水平越低，抗病毒治疗的效果显现越慢，免疫功能的重建及恢复耗时越长，但治疗的前3 个月是评估治疗效果好坏的关键期，大部分患者CD3+和CD8+T 淋巴细胞计数等指标都会发生明显变化，对于治疗不佳患者应考虑HIV 耐药及患者依从性或考虑调整用药方案。最后CD4/CD8 在治疗前、中、后比值都 <1，并不是一个理想的治疗效果评估指标。

研究的不足之处：（1）纳入的样本量及病原体种类较少；（2）没有对HIV 载量进行比较分析。笔者将在今后的研究中加大样本量与病原体种类，开展HIV 载量的检测及对比分析。