类风湿关节炎病证结合动物模型的研究进展

孙广瀚许 霞万 磊王玉凤南淑玲赵 黎刘 莹

安徽中医药大学，合肥230012

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性自身免疫性疾病，表现为持续的关节疼痛、肿胀等，反复滑膜炎、血管翳形成会导致关节畸形［1］。全球患病率约为1%［2］，男女发病率不同，约为1 ∶3［3］。对于研究类风湿关节炎，动物模型被广泛用于探索其发病机制和治疗方法的研究。目前已经建立多种动物模型用于研究RA 的发病机制，以及药物对其治疗作用，发现作用靶点，其中大致包括诱导关节炎模型、转基因动物的关节炎模型。为进一步阐明中医药的作用，构建出病证结合动物模型，这些模型各有优缺点。遂将上述诱导型关节炎模型，基因工程型动物模型，及病证结合动物模型进行介绍，以便风湿病科研人员在今后的研究中选择合适的动物模型，为治疗RA 顽疾而进一步开展研究。

1 诱导型关节炎模型

1.1 弗氏佐剂诱导的关节炎动物模型

1956 年Freund［4］报道给予佐剂进行大鼠关节炎，骨关节炎和骨膜炎的动物造模方法。其原理是利用结核分枝杆菌上的蛋白分子与关节滑膜上的相似，可以被同一株T 细胞所识别，从而诱发抗原抗体反应，引发炎症。在弗氏佐剂注射的大鼠中，促甲状腺激素水平的24 h 无明显变化，而催乳素和促肾上腺皮质激素的24 h 持续存在变化，说明弗氏佐剂注射后早期免疫介导的炎症反应对促肾上腺皮质激素、生长激素、催乳素和促甲状腺激素释放的显著影响［5］。并有研究［6］表明，使用弗氏佐剂结合低密度脂蛋白衍生的抗原对载脂蛋白E 缺陷小鼠进行免疫，可降低动脉粥样硬化病变的进展。使用弗氏佐剂单次皮下注射可诱导大鼠发生关节炎，而且还可以引发超出关节组织的其他全身反应［7］。并且多次注射发病率高于单次注射，发病快，在很短的时间内就可观察到病变。Nazirah Bashir 等［8］在尾巴根部一次皮内注射0.1 mL 弗氏完全佐剂，导致NF⁃κB、TGF⁃β、TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃6 和Hs⁃CRP 水平的增加和IL⁃10 水平的降低。

1.2 胶原诱导的关节炎动物模型

Trentham 等［9］报道了通过用同种或异种II 型胶原（Collagen type II，CII）完全或不完全弗氏佐剂进行皮内免疫在大鼠中诱发多关节炎。为了开发更适合RA 研究的自身免疫实验模型，向DBA／1 品系小鼠注射100 mg 纯化的天然异源CII，并表明向小鼠注射同源CII 引起的多关节炎比异源CII 引起的疾病在临床上更接近人类RA［10］。CII 是人软骨基质的主要成分，一般CIA 型动物模型用II 型胶原乳剂两次给药，分别行初次免疫与加强免疫，初次免疫在大鼠的尾根部和背部注射，在尾根部和背部皮内注射［11］，也有在腹侧和尾侧静脉之间的空间进行注射［12］。Chen 等［13］用等体积的不完全弗氏佐剂乳化了免疫级II 型牛II 型胶原蛋白，第一天将0.2 mL乳化液皮下注射到治疗组大鼠的尾巴基部，然后在一周后进行加强注射。除对动物的一般状态、体重变化、关节局部、足爪肿胀度、关节炎评分外，还进行病理学及血管内皮生长因子免疫组织化学法检测、滑膜微血管检测、细胞因子的检测［14⁃15］。

2 基因工程型关节炎模型

TNF⁃α 参与RA 的发病机制最初是由几种体外方法提出的，这些方法表明TNF⁃α 可以刺激人滑膜细胞和成纤维细胞中的胶原酶和许多其他基质金属蛋白酶和重组TNF⁃α。TNF⁃α 可能在细胞因子级联反应中处于上游低位，有实验［16］表明，阻断TNF⁃α的生物活性会抑制滑膜细胞中IL⁃1 的产生并中和IL⁃1 的生物活性，还抑制了其他几种促炎或免疫调节细胞因子的产生，包括粒细胞⁃巨噬细胞集落刺激因子，IL⁃6 和IL⁃8。TNF 转基因小鼠（TNF⁃Tg 系3647）最初是从Dr.G.Kollias 获得的，并与C57BL／6 小鼠回交了超过10 代。该系列的TNF⁃Tg 小鼠携带一种人TNF 转基因，并且相对缓慢地发展为慢性关节炎。TNF⁃Tg 小鼠1 mon 大时，踝关节健康。当2.5 mon 大时，出现轻度的踝关节发炎和骨侵蚀，5 mon 后会变得更加严重［17］。如朱兴旺等［18］即应用了人血清TNF⁃α 转基因小鼠模型，以观察中药复方对软骨侵蚀、骨质破坏的疗效。

由于K／BxN 血清转移模型依赖于富含自身抗体的血清向受体小鼠的被动转移，因此它触发了自身免疫性关节炎，其多关节炎症多类似RA，并在多种易感小鼠品系中具有近100%的渗透率。转基因K／BxN 小鼠的富含自身抗体的血清转移到幼稚的受体中而引起的，这种模型引发了剧烈的多关节炎。Bálint Botz 等［19］即应用了转基因K／BxN 小鼠研究，评估辣椒素敏感性传入分子在K／BxN 血清转移性关节炎小鼠模型中的作用。

其他还有用BAHR／c 小鼠中的促甲状腺素受体抗体进行的质粒18 或腺病毒诱导的19 免疫是最成功建立的模型，其表现出炎症改变和眼眶脂肪和肌肉体积增加［20］。也有将人HLADRα+4β 基因转入C57BL／6×DBA／1F 1 代小鼠复制出转基因动物后，在鼠体内注射胶原和佐剂免疫建立RA 模型［21］。

3 类风湿关节炎病证结合动物模型

3.1 风寒湿证

《素问·痹论》论述痹证病因为“风寒湿三气杂至，合而为痹也。”新疆地区RA 主要证型以风湿痹阻证为主［22］。且中医风寒湿证痹病不一定全是表现舌淡苔白脉紧，关节冷痛，四肢畏寒等症，也可夹杂热象［23］，故原针对RA 疾病造模所带来的炎性反应并不违背中医证候特点。许霞［24］等在建立佐剂性关节炎模型后，将大鼠放在2 cm 水深和5～7 ℃冷水条件中，站立20 min，并用风扇伴3～4 级风力，每天1 次，持续14 d，复制痹病中的风寒湿证，结果可见风寒湿证大鼠T 淋巴细胞中cAMP 含量、CD4+／CD8+T 细胞比值显著升高。或利用智能人工气候箱进行水温、风速等干预，结果大鼠足趾明显肿胀［25］。

3.2 风湿热证

金代张从正［26］”在《儒门事亲·指风痹痿厥近世差玄说》中提出“痹病以湿热为源，风寒湿为兼”。调查研究［27］发现，全国18 个中心的1388 例RA 患者中以湿热痹阻证疾病活动度最高，安徽地区RA中医证候也是以湿热痹阻为主［28］。全国18 家研究中心中女性RA 患者主要中医证候是湿热痹阻证［29］，说明湿热是现代临床中较为常见的中医证型。强宇靖［30］等将大鼠每天置于造模箱中接受风、湿、热刺激（温度35～37 ℃，湿度80%～99%，风速4 m／s，每次30 min），连续28 d。马腾茂［31］等除上述文献中进行温度、湿度、风速的刺激外，实验中还将大鼠足跖没入37 ℃热水中，大鼠全身以37 ℃蒸汽熏蒸，10 min 换气1 次。每天1 次，每次30 min，连续18 d。病理结果可见风湿热痹RA 大鼠踝关节大面积破坏，大量肉芽组织增生，大量炎性细胞浸润，肉芽组织血管丰富，血管扩张。

3.3 血瘀证

元代朱丹溪［32］在《丹溪心法·痛风论》中提出“恶血入经络证，血受湿热，久必凝浊，所下未尽，留滞隧道，所以作痛”，认为“瘀血流注”是其发生的主要病因。清代张璐［33］在《张氏医通·痿痹门》中言：“营卫滞而不行则麻木……木则全属湿痰死血”。李茜［34］等以皮下注射0.1 mg／kg 盐酸肾上腺素注射液及在冷水中游泳。但这种血瘀证更类似于寒凝血瘀。在其他疾病肾虚证的动物模型中还采取了其他造模方法，例如进行放血造模，结果可见肠系膜微淋巴管口径变细，自主收缩频率、总收缩活性指数、淋巴管动力学指数降低［35］。

3.4 肾虚证

清代喻嘉言［36］在《医门法律·中风门》更明确指出：“盖小儿非必为风寒湿所痹，多因先天所禀，肾气衰薄，随寒凝聚于腰膝而不解。”说明了肾虚是痹病重要的病因之一。王燕［37］等在胶原诱导性关节炎大鼠的基础上应用去势法（摘除双侧卵巢与睾丸）和羟基脲法（羟基脲375 mg／（kg·d-1）灌胃）制作肾虚证RA 大鼠模型，与CIA 大鼠相比，结合去势法、羟基脲法制作的肾虚CIA 大鼠关节红肿程度和关节损伤程度明显加重，并且出现精神萎靡、弓背蜷缩、体毛枯疏、自主活动少，反应逐渐迟钝，喜扎堆，饮食减少，大便质稀，肛周污秽等症状。肾上腺环腺苷酸与环鸟苷酸比值明显降低，IL⁃6、IL⁃10 及IFN⁃γ 水平明显升高，其中雄性大鼠皮质酮含量升高，雌性大鼠的皮质酮水平下降，抗Ⅱ型胶原抗体含量明显升高。在其他疾病肾虚证的动物模型中还采取了其他造模方法，例如灌胃给予150 mg·kg-1的腺嘌 呤［38］，或给予15 mg／（kg·d-1）氢化可的松［39］，或针对雄性大鼠以1 mL（1.5 mg）的甲睾酮及0.2 mL 猪油进行灌胃［40］。

3.5 脾虚证

宋代严用和［41］在《济生方·痹》提出痹病“皆因体虚，腠理空疏，受风寒湿气而成痹也。”而体虚中脾虚占重要地位，脾为营卫之气化生之源，清代林珮琴［42］在《类证治裁·痹证》更加明确地指出“诸痹……良由营卫先虚，腠理不密，风寒湿乘虚内袭，正气为邪气所阻，不能宣行，因而留滞，气血凝涩，久而成痹。”说明脾虚导致营卫不足，腠理不密，外邪内侵而致痹。在临床上从脾虚论治RA 可取得较好的疗效［43］。赵宏艳［44］等给予0.5 mg／（kg·d-1）的利血平腹腔注射制作脾虚证RA 大鼠模型。在其他疾病脾虚证的动物模型中还采取了其他造模方法，例如用灌胃60 g／（kg·d-1）的小承气汤并限制大鼠自主活动［45］，游泳致劳联合特制饲料喂养［46］，200%、剂量20 g／kg 的大黄进行灌胃配合隔天游泳及隔天禁食的方法［47］。

4 结语

近年来，类风湿关节炎的发病率逐渐上升，人们对其研究逐渐增多［48］。科研人员通过构建RA 动物模型来研究RA 的发生发展，并结合药物对其进一步研究。构建方法也从诱导型发展至基因工程等。但是，在使用基因工程技术为特定基因产生突变生物时，我们应仔细考虑可能产生的表型中存在发挥潜在作用的靶点。

辨证论治是中医治疗疾病的特色，《类风湿关节炎病证结合诊疗指南》中证型即有风湿痹阻证、寒湿痹阻证、湿热痹阻证、痰瘀痹阻证、瘀血阻络证、气血两虚证、肝肾不足证、气阴两虚证等［49］，在疾病发生中最主要的即湿热痹阻证与寒湿痹阻证，但两者在人口学特征上差异不明显，而临床指标方面，ESR、CRP、关节肿胀数与疾病活动度上有显著差异。采用大鼠复制RA 疾病再施加风、寒、湿、热等外因建立此模型，这种模型已经得到肯定，既满足中医证候特征，又符合RA 的病理特点，同时可以更好地阐明中医药的作用机制。但是这些造模方法只是单纯地将西医的“病”与中医的“证”相叠加，但是在检验造模是否成功时，没有收集中医证候四诊信息。而且现阶段中医证型造模单一，不能完全反映出具有中医特色的模型。另外对于痰瘀痹阻证、气阴两虚证大鼠模型缺乏研究文献，未来应该考虑对虚实夹杂等复杂病机的大鼠模型总结和研发。所以特别是在病证结合动物模型研究出一种与中医证候更贴近，方便进行后续药效或机制等的研究，操作更为便捷、经济，更加全面反应中医痹病特色的动物模型是今后研究RA 病证结合动物模型的重要内容之一。