硝苯地平片HPLC法含量测定的测量不确定度评定
2021-12-08王亚丽沈晓丽王秀霞李海芳
王亚丽 沈晓丽 王秀霞 李海芳
(新疆维吾尔自治区药品检验研究院，国家药品监督管理局中药(维药)质量控制重点实验室，乌鲁木齐 830054)
测量不确定度是表征合理地赋予被测量之值的分散性，是测量系统最基本的特性指标[1]。测量不确定度是衡量测试结果准确定和可靠性的重要参数，结果的表述同时包含被测量值及其测量不确定度才完整并有意义[2]。HPLC法是药物分析中的常用方法[3-8]，本文以硝苯地平片含量测定为例，参考 JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》[9]和《化学分析中不确定度的评估指南》[10]的要求，建立HPLC法测量不确定度评定的通用模型，可为测量数据的准确性和可靠性提供参考。
1 材料与方法
1.1 方法依据
硝苯地平片HPLC法含量测定按《中国药典》[11]2015年版四部通则0512，采用高效液相色谱外标法测定，计算硝苯地平含量。
1.2 仪器及试剂
1.2.1仪器
高效液相色谱仪，LC-20A，峰面积重复性限为0.1%；电子天平，XS 205DU，最大量程Max=81g，实际分度值d=0.01mg，检定分度值e=0.1mg，量程最大允许误差MPEV=0.02mg(10mg～5g)。
1.2.2试剂
对照品为硝苯地平标准品(批号：100338-201404，规格：20mg，99.9%)；供试品为硝苯地平片(批号为150503，标示量为5mg/片)；试剂均为分析纯，水为超纯水。
1.3 实验方法
1.3.1色谱条件
流动相为甲醇∶水(60∶40)；流速1.0mL/min；色谱柱选择C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温为35 ℃；进样量为20μL；检测波长235nm。
1.3.2对照品溶液的制备
取硝苯地平对照品约10mg，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释至10mL，再精密量取1mL定量稀释至50mL，作为对照品溶液。
1.3.3供试品溶液的制备
1.4 数学模型
检验指标：应为标示量的90.0%～110.0%
(1)
式中：
c对—对照品溶液中硝苯地平的浓度，g/mL；
A供—供试品的峰面积；
A对—对照品的峰面积；
c供—供试品溶液中硝苯地平的浓度，g/mL；
w标示量—标示量，本例为0.005g/片；
考虑到被测量的重复性影响不可忽略，加入重复性影响后，被测量按下式计算：
X′=X+XR
(2)
式中：
X′—加入重复性影响后的含量，%；
2 不确定度评定
2.1 不确定度来源分析
不确定度来源用因果图表示，见图1、图2。
图1 考虑重复性后不确定度来源因果图
图2 硝苯地平相对含量的不确定度来源因果图
2.2 合成标准不确定度表达式
各输入量不相关，由式(2)得合成标准不确定度表达式如下：
(3)
由式(1)，依据JJF 1135-2005《化学分析测量不确定度评定》[11]，忽略相关性，得：
(4)
2.3 标准不确定度的评定
2.3.1评定u(X)
2.3.1.1评定对照品溶液的浓度c的相对方差ur(c)
硝苯地平对照品由中国食品药品检定研究院提供，仅给出纯度为99.9%，并未给出其不确定度信息，故在此不对其进行评定，仅评定配制对照品溶液浓度带来的不确定度。对照品溶液的浓度不确定度由对照品称样量m对(10.05mg)和10mL容量瓶(A级)、50mL容量瓶(A级)和1mL移液管(A级)引入，由于c对=m对/V对，两输入量不相关，则：
(5)
(1)评定ur(m对)
对照品称样量m对(10.05mg)的不确定度由天平引入，天平的不确定度来源主要考虑允许误差和重复性误差，其中将重复性误差带来的不确定度含于整个测量过程的重复性XR之中。查天平检定证书，量程为10mg～5g的允差为±0.05mg，认为允差带来的不确定度属于矩形分布，则：
(2)评定ur(V对)
10mL容量瓶(A级)的不确定度来源主要考虑容量允许误差及温度影响，两者不相关。查JJG196-2006《中华人民共和国国家计量检定规程常用玻璃量器》[12]，容量为10mL的容量瓶(A级)容量允许误差为±0.020mL，认为是三角分布，则：
本次测量时实验室的温度为22℃，容量瓶校准时为20℃，由于液体的膨胀明显大于容量瓶的体积膨胀，故只考虑液体的体积膨胀，配置硝苯地平对照品的溶剂为甲醇，甲醇的膨胀系数为0.00118℃-1，因此产生的体积增量为10×0.00118×2=0.0236mL，视体积增量为变化范围半宽，假设体积变化服从三角分布，则：
查JJG 196-2006，容量为50mL的容量瓶(A级)容量允许误差为±0.05mL，认为是三角分布，则：
其产生的体积增量为50×0.00118×2=0.118mL，则：
查JJG 196-2006《常用玻璃量器》，单标线1mL的移液管(A级)允许误差为±0.007mL，认为是三角分布，则：
其产生的体积增量为1×0.00118×2=0.00236mL，则：
=0.00344
(3)评定ur(c)
由式(5)得：
2.3.1.2评定对照品溶液峰面积A对的相对标准不确定度ur(A)
对照品溶液重复进样6次，测量得到6个峰面积，分别为1528208、1527611、1527848、1527480、1527993、1528018，平均值为1527860，对照品溶液峰面积重复测量引入的相对标准不确定度为：
2.3.1.3评定供试品溶液峰面积A供的相对标准不确定度ur(A供)
每份样品溶液分别进样3次，得到3个峰面积，用极差法计算样品溶液峰面积重复测量引入的相对标准不确定度，试样1(可以其中任意1份样品的测定结果计算)的峰面积分别为1396292、1392264、1394321，平均值为1394292，极差R=4028，取n=3时，极差系数C=1.69，则：
2.3.1.4评定供试品溶液的浓度c供的相对标准不确定度ur(c供)
供试品溶液浓度的不确定度由供试品称样量m供(0.15g)和50mL容量瓶(A级)、50mL容量瓶(A级)和5mL移液管(A级)引入引入，c供=m供/V供两输入量不相关，则：
(1)评定ur(m供)
供试品称样量m供(约0.15g)的不确定度由天平引入，分析同5.1.1.1，查天平检定证书，量程为10mg≤m≤50g时，最大允差为±0.5mg，认为是矩形分布，则：
(2)评定ur(V供)
供试品稀释时两次用到50mL单标线容量瓶(A级)，5.1.1.2 评定ur(V50)由式(15)可知ur(V50)=0.00105查JJG 196-2006，容量为5mL的单标线移液管(A级)容量允许误差为±0.015mL，认为是三角分布，则：
其产生的体积增量为5×0.00118×2=0.0118mL，则：
=0.00215
(3)评定ur(c供)
供试品平均片重(0.084g/片)的不确定度由天平引入，分析同5.1.1.1，查天平检定证书，量程为10mg≤m≤50g时，最大允差为0.5mg，认为是矩形分布，则：
2.3.1.6评定u(X)
将各个分量代入式(4)得：
u(X)=ur(X)X=0.00670×97.8%=0.655%
2.3.2评定u(XR)
为评定u(XR)，取10份样品进行重复性测定，测量数据见表2。
表2 X重复性测定
用贝塞尔公式计算标准差：
正常检验测量两次取平均值，故：
2.4 合成标准不确定度的评定
由式(3)可得：
=0.67%
2.5 扩展不确定度的评定
按JJF 1059.1-2012的规定[13]，一般测量，可取包含因子k=2，则扩展不确定度为：
U=kuc(X')=2×0.67%=1.3%
2.6 测量报告结果
硝苯地平片HPLC法含量测量结果为：97.8±1.3%，k=2。
3 结论
由评定结果可知，测量结果的不确定度的主要来源是对照品和供试品的称量、稀释配制以及测量重复性引入的，其他分量引入的不确定度相对较小。因此在实际操作过程中，操作人员应适当增加对照品的称样量，尽量减少稀释步骤，转移、稀释时使用检定级别较高的玻璃量器，选用精度符合要求并经检定合格的电子天平。人员要具备与检验工作相适应的操作水平，以提高检测结果的准确性。
