LC-MS/MS法测定人体血清中脂溶性维生素浓度

陈敏纯 张婧一 郑 洁 王 新 刘生元 曹 青 闫抗抗

(西北大学附属医院/西安市第三医院药剂科，西安 710018)

维生素(Vitamin)是维持人体健康的必需微量元素，其以酶或辅酶的形式参与人体新陈代谢过程，调节人体的生长、发育[1]。维生素A、25-OH-D2、25-OH-D3、维生素E是脂溶性维生素，因人体不能合成或合成的维生素极其微量，只能从食物中摄取。脂溶性维生素摄取不足或缺乏，易导致人体生理机能、新陈代谢、细胞调节等障碍，诱发多种疾病[2-4]。一般而言，成人均衡膳食无需额外补充脂溶性维生素，但特殊人群如孕妇，老年人，骨质疏松患者以及儿童普遍缺乏维生素，若盲目补充大量，易蓄积致中毒。如早期妊娠妇女摄取大量维生素A(摄入量≥10000IU)增加婴儿出生缺陷风险[5]。对于存在营养吸收障碍者、有肝脏疾病者以及炎症性肠病者或生长迟缓儿童，应常规监测脂溶性维生素的浓度。对于这些特殊人群者，通常每6个月监测1次，具体监测频率取决于疾病的严重程度[6]。故科学、精准的检测人体脂溶性维生素含量，可准确评估、筛查脂溶性维生素维生素异常状态，针对性进行个体化调整补充，提高维生素治疗的安全性有效性。本实验研究建立LC-MS/MS法同时测定人体血清中脂溶性维生素A、25-OH-D2、25-OH-D3、E的质量浓度，所需样本量少(200μL血清)，样品前处理简单(正己烷萃取法)，采用同位素内标，消除人体血清中的不同内源性物质对维生素检测的基质效应，准确度高且一次性检测4项脂溶性维生素，为临床评估脂溶性维生素含量提供可靠的检测方法。

1 仪器与试剂

液质联用仪(液相色谱仪LC-30A，质谱仪LC-MS 8040三重四级杆，LC-30AD×2 输液泵，SIL-30AC 自动进样器，CTO-20AC 柱温箱)；色谱工作站：LabSolution；高速冷冻离心机(H2050R)；涡旋仪(MTV-100)；氮吹仪(MTN-2800D )。

甲醇为色谱级试剂；正己烷为色谱级；甲酸为色谱级纯试剂；标准品维生素A、25-OH-D2、25-OH-D3、E和稳定同位素内标A-d4、25-OH-D2-d6、25-OH-D3-d6、VE-d6购自于生物科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA，9048-46-8)。

2 方法与结果

2.1 LC-MS/MS条件

色谱条件：色谱柱：Zorbax Extend-C18 柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm，)；流动相：A相-0.1%甲酸水溶液，B相-0.1%甲酸甲醇；梯度洗脱，0～2min，85% B相-100% B相，2～6min，100% B相；柱温：45 ℃；流速：0.6 mL/min；进样量：50 μL。质谱条件：采用ESI源正离子模式；雾化气流量：2.5 L/min；干燥气流量：15 L/min；DL 温度：200 ℃；加热块温度：300 ℃；用于定量分析的4种维生素和内标最优的MRM参数见表1。

表1 4种维生素及其内标最优的MRM参数

2.2 溶液配制

用甲醇配制2.536 mg/mL、0.200 mg/mL、0.200 mg/mL、20.480 mg/mL的VA、25-OH-D2、25-OH-D3、VE混合标准储备液，将储备液逐级稀释，VA的标准工作液为0.5072、1.268、2.536、6.340、12.680、25.360 μg/mL；25-OH-D2和25-OH-D3的标准工作液为0.040、0.100、0.200、0.500、1.000、2.000 μg/mL；VE的标准工作液为4.096、10.240、20.480、51.200、102.400、204.800 μg/mL。内标工作液浓度为20 ng/mL。

2.3 样品前处理

用移液器精密吸取200 μL内标工作液加入200 μL血清样品，涡旋震荡1 min，吸取900 μL 正己烷，涡旋震荡5 min，置于4℃、12000 rpm超高速离心机中离心10 min，吸取600 μL 上清液，于氮吹仪中吹干，用100 μL的 70%甲醇水复溶，涡旋震荡2 min，置于4℃、12000 rpm超高速离心机中离心3 min，取上清液 90 μL进样分析检测。

2.4 标准曲线配制与检测限

称取0.4 g BSA溶于10 mL水中，配制成4% BSA溶液作为代替血清的基质溶液，用于配制标准曲线。用移液器吸取180 μL基质溶液，精密吸取20 μL不同浓度的标准工作液和200 μL内标工作液，依次配制成标准曲线。按“2.3”项下处理，分析检测记录VA、25-OH-D2、25-OH-D3、VE面积与内标色谱峰面积。峰面积比Y对浓度(X，μg/mL)进行线性回归(权重为1/C)，回归方程Y=bX+a。结果表明各维生素色谱响应的相关线性关系良好。配制20份样品浓度VA为0.057 μg/mL、25-OH-D2为0.004 μg/mL、25-OH-D3为0.004 μg/mL、VE为0.409 μg/mL进行分析，统计峰面积比，计算精密度值<20%，表明VA为0.057 μg/mL，25-OH-D2为0.004 μg/mL，25-OH-D3为0.004 μg/mL，VE为0.409 μg/mL可作为方法检出限。各个维生素的线性范围、直线回归方程、线性相关系数、检测限如表2所示。

表2 脂溶性维生素线性范围、回归方程、相关系数及检测限

2.5 方法专属性

在本试验条件下，检测空白基质溶液、空白基质溶液加入脂溶性维生素标准品和内标及患者血清中脂溶性维生素和内标。结果表明，血清中内源性物质对脂溶性维生素样品峰的测定无干扰。本方法具有较高的特异性，色谱图见图1。

图1 脂溶性维生素色谱图A.4% BSA加入高质控样品及内标；B.患者脂溶性维生素色谱图

2.6 精密度和准确度

平行制备低、中、高质控样品各8份，连续3d进样分析，计算日内、日间精密度和准确度，结果见表3。

表3 方法精密度准确度及提取回收率(n=8)

续表3

2.7 回收率与基质效应

取180μL基质溶液，分别吸取20 μL低、中、高质控浓度的标准工作液和200 μL内标工作液，每个浓度分析8份样品，按“2.3”项下处理，进行分析记录峰面积A。取180 μL水，分别吸取20 μL低、中、高质控浓度的标准工作液和200 μL内标工作液，按“2.3”项下处理，进行分析记录峰面积B。取180 μL空白血清分别吸取20 μL低、中、高质控浓度的标准工作液和200 μL内标工作液，按“2.3”项下处理，进行分析记录峰面积C。取180 μL空白血清，按“2.3”项下处理，进行分析记录峰面积D。A/B为本方法的基质效应，(C-D)/A为本方法的加标回收率。结果见表3。

2.8 基质溶液与空白血清的基质一致性验证

分别用4% BSA 基质溶液和空白血清依照“标准曲线配制”中的方法，配制标准曲线溶液，进样分析，绘制出BSA基质标曲Y=bX+a和血清基质标曲Y=b'X+a'，依据标准加入法外推X 轴负截距，计算空白血清中VA、25-OH-D2、25-OH-D3、VE的含量分别为0.4036、0.0031、0.0603、7.3964 μg/mL。分别制备空白血清及血清加入低、中、高质控浓度的标准工作液和200 μL内标工作液，每个浓度分析8份样品，按“2.3”项下处理，进样分析后根据4% BSA基质溶液标准曲线计算目标物质浓度。结果显示，使用4% BSA 基质溶液标准曲线测定各组样品，其检测均值和理论值相对误差均<15%，变异系数<15%，均在可接受范围之内。

2.9 临床样本检测结果

应用所建立LC-MS/MS法测定20名健康者血清中脂溶性维生素，结果范围如表4所示。各临床样品测定数值均在正常范围内，因此该方法适用于临床血清样品的检测。

表4 健康者血清脂溶性维生素检测结果

3 讨论

维生素A有多种生物学调节作用，预防干眼症、角膜和结膜发育异常，同时对眼部的细胞分化有重要作用。根据世界卫生组织2018年数据显示，全球5岁以下儿童的VA缺乏症患病率约为30%，许多营养不良的儿童和成人出现夜盲症、失明和干眼症。VA缺乏症的诊断是通过其临床表现，若测量血清VA浓度低于0.2 μg/mL也可支持诊断[7]。维生素E是保护细胞膜免受氧化和破坏。VE缺乏可导致溶血、神经肌肉疾病、共济失调和周围神经病变。由于人类饮食中含有丰富的VE，VE缺乏症很少见，除非患有胆汁淤积性肝病、胰腺功能不全或其他导致脂肪吸收障碍或蛋白质吸收不良的人，对于有维生素E缺乏风险因素的患者需常规监测VE含量。维生素D除了在钙和骨稳态中发挥作用以外，其还调节细胞增殖、免疫和肌肉功能、皮肤分化和生殖以及血管和代谢特性[8]。维生素D缺乏(血清25-OH-D浓度 <20 ng/mL)会加速骨转换、骨丢失和骨质疏松性骨折。若大剂量补充维生素D使血清25-OH-D浓度超过50 ng/mL，则会增加跌倒风险[9]。25-OH-D2和25-OH-D3是25-OH-D的两种形式，他们具有不同强度的生物学调节作用，研究认为应对这两种形式进行分别检测，在美国国家标准和技术研究院(National Institute for Standards and Technology,NIST)标准下，LC-MS/MS技术是测定维生素D为最准确的技术[10]，而应用免疫法则无法区分25-OH-D2和25-OH-D3。因此，应用LC-MS/MS技术不仅可区分和定量25-OH-D不同亚型，也可同时检测多种脂溶性维生素，为临床医生对维生素异常者进行医学干预提供重要的参考意义。

脂溶性维生素在人体中含量差异大，如VA和VE在正常人中含量高达μg/mL级别，而25-OH-D2和25-OH-D3则为ng/mL级别，LC-MS/MS技术同时检测这几种化合物不仅可满足其高灵敏度需求，也同时满足线性相关性。因脂溶性维生素的官能团和分子结构不同，导致其极性差异大，VA、25-OH-D2和25-OH-D3的极性相对较强，在色谱柱上易被洗脱，而VE则极性较弱，难以被洗脱，故本研究流动相采用梯度洗脱，0.1%甲酸甲醇溶液由85%逐步上升到100%进行洗脱。此外，本研究采用同位素内标，以消除人体血清中的不同内源性物质对维生素检测的基质效应，大大提高检测结果的准确性。

维生素是人体内源性物质，正常人血清中含有一定量的脂溶性维生素，不宜使用空白血清建立标准曲线进行定量，故本研究采用4% BSA溶液作为血清的替代基质溶液，同时对4% BSA替代基质溶液与血清基质溶液进行一致性验证，检测均值和理论值相对误差<15%，变异系数<15%，均在可接受范围之内。LC-MS/MS法对化合物进行定量检测时，在不同基质溶液中该化合物的溶解度及离子响应度则不同，为减小差异及影响，本研究在质量控制技术上采用的是加标回收率，确保试验技术的可靠性。

本研究通过4% BSA基质溶液替代空白血清配制标曲，正己烷萃取法及内标定量法，建立了在6 min内测定血清中脂溶性维生素的分析方法，并按照临床检验相关指导原则进行方法学验证。实验结果表明，该方法分析速度快、准确度和精密度好，适用于临床实验中测定人血清中脂溶性维生素的含量，指导相关疾病治疗及临床合理用药。