土壤调理剂对烟田土壤真菌群落及土壤属性的影响

2021-12-08王国谋拓阳阳李红丽陈玉蓝王岩

贵州农业科学 2021年10期

王国谋，拓阳阳，李红丽，陈玉蓝，王岩

(1.四川省烟草公司凉山州公司德昌分公司，四川德昌 615500； 2.郑州大学生态与环境学院，河南郑州 450001； 3.四川省烟草公司凉山州公司，四川西昌 615100)

0 引言

【研究意义】土壤是农业生产过程中的养分来源和重要载体，良好的土壤条件是生产优质作物的基础。但由于烟叶连作致使烟田出现土壤酸化等理化性状恶化系列问题[1]。【前人研究进展】土壤pH降低影响土壤中相关微生物的多样性和酶活性[2]。在pH过低的土壤中，烟叶中的烟碱含量呈现增加的趋势，致使糖碱比趋于不协调，影响烟草生长发育和烟叶品质的形成[3]，同时土壤中钾、镁、钙的有效量降至最低，烤烟死根现象也常有发生[4]。一般认为pH在5.5～6.5适宜生产优质烟叶[5]。陈江华等[6]分析指出，全国范围内主要烟区的植烟土壤中pH处于4.5～5.5(酸性)的土壤占18.6%，pH<4.5(极酸性)的土壤占2.4%。我国很多主产烟区均不同程度地出现土壤酸化现象[7-9]，土壤酸化已成为制约烟区发展的重要限制因子。【研究切入点】以往我国烟区常用石灰石粉或白云石粉调控土壤pH[10]，忽略对烟草生长和品质以及大量钙镁进入土壤后对烟叶吸收钾素的消极影响。土壤调理剂可以改善土壤微生物群落结构、土壤理化性质，促进烟株生长发育[11]。施用土壤调理剂有降低土壤酸性、调理酸性土壤理化性质、提高有机质含量等主要功能。【拟解决的关键问题】为验证土壤调理剂对烟区土壤的改良效果及对烤烟生长发育和品质的影响，在四川省凉山彝族自治州德昌县酸性烟田进行试验，在常规施肥的基础上增施高碳基土壤调理剂和高钙高镁土壤调理剂，通过与常规施肥对比，研究烟田土壤微生物的Alpha多样性、微生物群落组成及环境因子的相关性，为改良酸性土壤及烟草生产中土壤调理剂的科学施用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验田概况

试验于2019年在四川省凉山彝族自治州德昌县团山烟点进行，试验地位于东经102°20′，北纬27°12′，海拔1 487 m，降雨量1 049 mm。植烟土壤为黄壤土，质地为砂壤土，pH为5.25，有机质为17.73 g/kg，全氮为0.78 g/kg，碱解氮为87.15 mg/kg，速效钾为250.12 mg/kg，有效磷为56.85 mg/kg，交换性钙为203.45 mg/kg，交换性镁为25.62 mg/kg。

1.2 材料

云烟87的种子由云南玉溪种子公司提供。

1.3 方法

1.3.1 试验设计试验设置常规施肥(T1)，常规施肥+高碳基土壤调理剂(生物质炭，T2)，常规施肥+高钙高镁土壤调理剂(CaO∶MgO∶有机肥为1∶1∶6，T3)3个处理：每个处理3次重复，小区随机排列，每个小区面积667 m2。T1，移栽前施用50 kg/667m2腐熟羊粪有机肥和45 kg/667m2复合肥，其中氮磷钾的质量比为1∶1∶3.5；T2，增施高碳基土壤调理剂80 kg/667m2；T3，增施高钙高镁土壤调理剂80 kg/667m2(含钙7.2 kg/667m2，含镁6.0 kg/667m2)。4月28日移栽，株行距为120 cm×50 cm，施肥方式为穴施，其他田间农艺操作按当地优质烟叶生产技术规范进行。

1.3.2 样品采集分别于烟株移栽前(4月27日)、团棵期(6月3日)及成熟期(8月29日)采集土壤样本，在每个小区采用5点取样法，混合后采用四分法留取1 kg的土样，除去根、砾石等杂质后，取5 g左右土样，装入15 mL带盖的离心管，-20℃保存，及时进行微生物多样性测序与分析；剩余的土样带回实验室，经风干、研磨过筛后用于测定土壤理化性质。不同时期取样的样本编号：移栽前为YD3_1，T1、T2、T3处理样本在团棵期分别为TD3_1、TD3_2、TD3_3，成熟期为CD3_1、CD3_2、CD3_3，每个样本取3个平行样。

1.3.3 微生物高通量基因测定在上海美吉生物医药科技有限公司对土样微生物进行16S/18S多样性测序，具体方法详见李忠奎等[12]的报道。Alpha多样性反应微生物群落的丰富度和多样性，丰富度指数有Sobs指数、Chao1指数，其中Sobs指数是丰富度的实际观测值，Chao1指数是根据公式的计算值，多样性指数有Shannon指数。将相对丰度超过5%的认定为优势菌。

1.3.4 烟株经济性状调查烟叶单独采收烘烤，统计烤后烟叶产量，并由当地烟草站专业技术人员根据烤烟 42级国标(GB 2635—92)对烤后烟叶分级，参照当年的烟叶收购价格，确定烤烟的产值。

1.3.5 土壤养分含量测定方法土壤含水率测定采用烘干法，pH采用电位法测定，有机质采用重铬酸钾-油浴法测定，碱解氮用碱解扩散法测定，有效磷用碳酸氢钠提取-钼锑抗比色法测定，速效钾用乙酸铵提取-原子吸收法测定[13]。

1.4 数据处理

采用Excel 2010、SPSS 17.0和生信软件对数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 烟田土壤真菌Alpha多样性及真菌Betta多样性

2.1.1 Alpha多样性如表1所示，土样真菌Alpha多样性测定Coverage指数均≥0.98，说明取样可靠。随着烟株生长期，所有处理土壤真菌Sobs指数和Chao1指数呈先增后减趋势，Shannon指数则呈先降后增趋势，说明植烟后土壤中某些种类真菌大量繁殖，使真菌总数增加，但多样性降低。不同处理相比，在团棵期，T1的真菌丰富度和多样性高于T2和T3处理，说明施用土壤调理剂抑制了某些真菌的生长。在成熟期，Sobs指数、Chao1指数和Shannon指数在各处理间均无显著差异。T3的Sobs指数最低，Shannon指数最高，表明施用高钙高镁土壤调理剂会抑制某些真菌，土壤真菌的多样性稍有提高。

表 1 不同处理烟田土壤真菌Alpha多样性

2.1.2 Betta多样性如图1所示，土样在OTU水平上的主成分分析，真菌在不同生长时期相差较大，移栽前单独分开，与团稞期和成熟期差异较大，团稞期T1和T2相距较近，表明群落结构比较相似，与T3相差较大，说明施用高钙高镁土壤调理剂抑制某些真菌生长，改变土壤真菌菌落。成熟期3个处理间差异较小，无明显差异。

图 1 不同时期土壤真菌的Betta多样性

2.2 烟田土壤真菌群落结构及差异性

2.2.1 群落结构如图2所示，主要优势菌门有子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和unclassified_k_Fungi，合计相对丰度占整个真菌门的91%以上，以团棵期时T3最低，91.70%。子囊菌门移栽前为相对丰度为80.97%，团稞期时T1下降至最低，为78.34%；T2最高，为90.64%；成熟期稍有增加，T2最高，为94.99%；T3最低，为90.17%，说明添加高碳基土壤调理剂有利于子囊菌门的生长。担子菌门移栽前最高，为14.73%；无比信息团稞期显著降低，T1最高，为7.47%；T3最低，为2.25%；成熟期T1继续降低，为3.82%；T2最低，为3.44%；表明高钙高镁土壤调理剂抑制担子菌门。unclassified_k_Fungi移栽前为1.83%，团稞期显著增加，T1最高，为6.19%；T2最低，为1.63%；成熟期降低，T3最高，为0.95%。

图 2 不同处理的土壤真菌在门和属水平上的群落组成

在属的水平上，毛壳菌属(Chaetomium)、unclassified_p_Ascomycota子囊菌门、枝孢属(Cladosporium)、Boeremia为移栽前优势真菌属，曲霉属(Aspergillus)、毛壳菌属、unclassified_p_Ascomycota、unclassified_o_Eurotiales(散囊菌目)、unclassified_f_Aspergillaceae(曲霉科)、镰刀菌属(Fusarium)为团棵期和成熟期优势真菌属。从移栽前到成熟期，曲霉属的相对丰度逐渐增加，移栽前最低为2.61%，团稞期T3显著增至最高，为35.10%，TD3＿1最低(8.08%)，但与T2无显著差异。成熟期继续增加，T2最高，为41.56%，T3最低，为32.51%，说明施用高碳基土壤调理剂有利于曲霉属生长，曲霉属为子囊菌门，与其门的变化一致。毛壳菌属在移栽前为12.12%，团棵期显著增加，T2最高，为39.15%；T3最低，为20.78%；成熟期又下降，T1最高，为18.39%；T2最低，为7.97%。子囊菌门未分类菌属的相对丰度先减少后增加，移栽前最高，为15.89%；团稞期显著下降，T3最高，为4.63%；T2最低，为3.45%；成熟期又增加，3个处理T1最低，但与T2和T3基本一致，但无显著性差异。unclassified_o_Eurotiales属移栽前最低，为0.72%，团稞期T1最低，为0.61%；T3最高，为2.36%；成熟期显著增加，T1最低，为8.43%，T2和T3无显著性差异。unclassified_f_Aspergillaceae属移栽前为3.01%，团稞期T1最低，为1.58%；T3最高，为2.36%；成熟期显著增加，T1最低，为5.23%；T2最高，为7.86%，与曲霉属变化一致。镰刀菌属移栽前为4.32%，团稞期T3最低为2.44%；T2最高为6.19%；成熟期都降低，T2最低，为1.55%；T3最高，为1.70%，3个处理无显著性差异。施用土壤调理剂对烟株土壤真菌的影响较大，提高土壤中曲霉属、毛壳菌属、unclassified_o_Eurotiales、unclassified_f_Aspergillaceae的相对丰度，表明高钙高镁土壤调理剂在团棵期即可有效抑制有害菌镰刀菌属的生长。

2.2.2 差异性如图3所示，在门水平上有显著差异的优势菌是子囊菌门，其移栽前显著低于成熟期，成熟期T2最高，说明施用土壤调理剂提高土壤中子囊菌门的相对丰度。属水平上有显著差异的优势菌是unclassified_o_Eurotiales，其移栽前显著低于成熟期，成熟期T2和T3虽无显著性差异，但均显著高于对照，说明施用土壤调理剂提高土壤中显著差异菌属的相对丰度。为相对丰度为80.97%，团稞期时T1下降至最低，为78.34%；T2最高，为90.64%；成熟期稍有增加，T2最高，为94.99%；T3最低，为90.17%，说明添加高碳基土壤调理剂有利于子囊菌门的生长。担子菌门移栽前最高，为14.73%；团稞期显著降低，T1最高，为7.47%；T3最低，为2.25%；成熟期T1继续降低，为3.82%；T2最低，为3.44%；表明高钙高镁土壤调理剂抑制担子菌门。unclassified_k_Fungi移栽前为1.83%，团稞期显著增加，T1最高，为6.19%；T2最低，为1.63%；成熟期降低，T3最高，为0.95%。

图3 土壤真菌在门水平和属水平上的差异

在属的水平上，毛壳菌属(Chaetomium)、unclassified_p_Ascomycota子囊菌门、枝孢属(Cladosporium)、Boeremia为移栽前优势真菌属，曲霉属(Aspergillus)、毛壳菌属、unclassified_p_Ascomycota、unclassified_o_Eurotiales(散囊菌目)、unclassified_f_Aspergillaceae(曲霉科)、镰刀菌属(Fusarium)为团棵期和成熟期优势真菌属。从移栽前到成熟期，曲霉属的相对丰度逐渐增加，移栽前最低为2.61%，团稞期T3显著增至最高，为35.10%，TD3-1最低(8.08%)，但与T2无显著差异。成熟期继续增加，T2最高，为41.56%，T3最低，为32.51%，说明施用高碳基土壤调理剂有利于曲霉属生长，曲霉属为子囊菌门，与其门的变化一致。毛壳菌属在移栽前为12.12%，团棵期显著增加，T2最高，为39.15%；T3最低，为20.78%；成熟期又下降，T1最高，为18.39%；T2最低，为7.97%。子囊菌门未分类菌属的相对丰度先减少后增加，移栽前最高，为15.89%；团稞期显著下降，T3最高，为4.63%；T2最低，为3.45%；成熟期又增加，3个处理T1最低，但与T2和T3基本一致，无显著性差异。unclassified_o_Eurotiales属移栽前最低，为0.72%，团稞期T1最低，为0.61%；T3最高，为2.36%；成熟期显著增加，T1最低，为8.43%，T2和T3无显著性差异。unclassified_f_Aspergillaceae属移栽前为3.01%，团稞期T1最低，为1.58%；T3最高，为2.36%；成熟期显著增加，T1最低，为5.23%；T2最高，为7.86%，与曲霉属变化一致。镰刀菌属移栽前为4.32%，团稞期T3最低为2.44%；T2最高为6.19%；成熟期均降低，T2最低，为1.55%；T3最高，为1.70%，3个处理无显著性差异。施用土壤调理剂对烟株土壤真菌的影响较大，提高土壤中曲霉属、毛壳菌属、unclassified_o_Eurotiales、unclassified_f_Aspergillaceae的相对丰度，表明高钙高镁土壤调理剂在团棵期即可有效抑制有害菌镰刀菌属的生长。

2.3 烟田土壤微生物群落结构与养分的相关性

2.3.1 养分含量土壤偏酸性，植烟后pH降低，成熟期T2和T3较T1分别提高0.56和0.51显著高于对照T1。成熟期T2和T3养分含量显著高于T1，有机质分别提高14.26%和10.89%，碱解氮分别提高9.48%和2.9%，有效磷分别提高8.69%和13.00%，速效钾分别提高28.75%和20.78%，但均未达显著差异，T3处理的交换性钙和交换性镁显著高于另外2个处理，表明施用土壤调理剂能提高土壤有机质和养分含量，显著提高土壤pH和交换性钙与交换性镁，特别是施用高钙高镁土壤调理剂对土壤交换性钙和交换性镁的含量提高显著，但低于凉山州会理县和宁南县烟田，会理县的交换性钙和交换性镁分别为998.06 mg/kg和268.79 mg/kg。

表2 不同处理土壤水分与养分含量

2.3.2 真菌群落结构与环境因子的RDA如图4和表3所示，在门水平上，第一主轴和第二主轴共解释物种和环境因子总方差的85.72%，pH无显著相关，其余因子都与第一主轴相关，碱解氮(AN)为极显著正相关，含水率(MC)、有机质(OM)、速效钾(AK)和有效磷(AP)为极显著负相关。与子囊菌门正相关的是MC、OM、AK和AP，与担子菌门极显著正相关的是碱解氮。在属水平上，第一和第二主轴共解释物种和环境因子总方差的77.73%，环境因子主轴的相关性与在门水平上一致。与曲霉属极显著正相关的因素与子囊菌门一致，AK极显著负相关。成熟期土样受OM、AK和AP影响较大，移栽前样本与AN显著相关。

图4 真菌在门与属水平上与土壤理化性质的冗余

表 3 RDA分析土壤属性对不同水平真菌群落结构的显著性

2.3.3 真菌结构与养分含量的Heatmap如图5所示，7种菌属与有机质显著相关，Aspergillus呈极显著正相关，unclassified_o_Eurotiales呈显著正相关，Boeremia、Saitozyma、uncassified_c_Sordariomyceles呈极显著负相关，Cladosporium和Fusarium呈显著负相关。4种菌属与碱解氮显著相关，Aspergillus呈极显著负相关，Boeremia、Fusarium和uncassified_c_Sordariomyceles呈显著正相关，5种菌属与有效磷有相关性，unclassified_o_Eurotiales呈极显著正相关，Cladosporium和uncassified_c_Sordariomyceles呈极显著负相关，Boeremia和Sailtozyma呈显著负相关。5种菌属与速效钾显著相关，unclassified_o_Eurotiales呈极显著正相关，Aspergillus呈显著正相关，uncassified_c_Sordariomyceles呈极显著负相关，Cladosporium和Sailtozyma呈显著负相关。6种菌属与含水率相关，Aspergillus和unclassified_o_Eurotiales呈显著正相关，Cladosporium、Sailtozyma、uncassified_c_Sordariomyceles和uncassified_p_Ascomycota呈显著负相关。没有与pH相关的真菌菌属。与养分极显著正相关的菌属有unclassified_o_Eurotiales和Aspergillus，极显著负相关的有uncassified_c_Sordariomyceles、Cladosporium和Cladosporium。其中，与有机质、有效磷和速效钾极显著相关的微生物比较多，而土壤调理剂能改变土壤有机质、有效磷和速效钾，改善土壤微环境。

图 5 基于Heatmap土壤真菌群落结构在属水平上与养分含量的相关性

2.4 不同土壤调理剂处理烤烟的经济性状

如表4所示，T2和T3所有经济性状指标均高于T1，T2和T3均价均超过20元/kg，T3上中等烟比例超80%。T2和T3较T1产量分别增加17.73%和22.10%，产值分别增加26.20%和41.69%。表明，调理剂均可提高烤烟的经济价值。

表 4 土壤调理剂处理烤后烟叶经济性状

3 讨论

土壤酸碱度是影响微生物活性和土壤肥力的重要因素。土壤酸化加剧了盐基离子的淋溶，致使土壤贫瘠，不利于作物生长[14]。此外，pH是烤烟根系活力的主要制约因子[15]。酸性土壤施用土壤调理剂能够在一定程度上改善植烟土壤的物理、化学及生物性状以及提高烤烟的产量产值[16-17]。研究结果，与常规施肥相比，常规施肥+高碳基土壤调理剂和常规施肥+高钙高镁型土壤调理剂pH分别增加0.56和0.51，经济性状也显著提升，这与薛超群等[18-20]研究结果一致，表明土壤调理剂可改善烤烟根系的微环境和营养状况，促进烤烟的生长发育。

PHLIPPOT等[21]研究表明，土壤微生物群落是保证土壤生态系统持续发挥作用的重要媒介，土壤微生物群落结构多样性是衡量土壤健康状态的重要指标。从土壤真菌群落组成分析表明，Aspergillus在土壤中比较常见，一般不侵染烟草，但当烟草受根结线虫侵染时也会引起根腐，而研究表明，施用高钙高镁土壤调理剂降低黑曲霉(Aspergillus)。unclassified_o_Eurotiales属于散囊菌目(Eurotiomycetes)，是子囊菌门(Ascomycota)的一种复杂的丝状子囊真菌，可以分解木质素、角质素等难降解的有机质，在养分循环中担任重要角色[22]，研究表明，施用土壤调理剂增加unclassified_o_Eurotiales。

土壤微生物群落结构和多样性不仅受土壤类型、土壤养分、植被类型、气候条件和人类活动等的影响[23]。成熟期烟田土壤养分与常规施肥相比，施用土壤调理剂的土壤养分含量均增加，尤其是土壤速效钾含量，钾能促进植株茎秆健壮，增强叶片光合作用，是植物生长发育过程中的必需的矿质营养元素。常规施肥+高碳基土壤调理剂和常规施肥+高钙高镁型土壤调理剂较常规施肥分别提高28.75%和20.78%，unclassified_o_Eurotiales与土壤速效钾极显著正相关，Aspergillus呈显著正相关，这2种菌属从团棵期开始显著增加。适宜的土壤有机质含量是生产优质烟的必备条件，李盼盼等[24]研究表明，在一定范围内土壤有机质含量的升高可以增加烟草内生真菌的物种丰富度。研究发现，施用高碳基土壤调理剂的常规施肥+高碳基土壤调理剂和高钙高镁土壤调理剂的常规施肥+高钙高镁型土壤调理剂比对照(T1)的土壤有机质含量分别提高14.26%和10.89%，Aspergillus与有机质极显著正相关，unclassified_o_Eurotiales呈显著正相关，其变化与速效钾一致。施用土壤调理剂提高土壤速效钾和有机质，与之正相关的真菌显著增加。土壤氮与烤烟生物量和产量的变化密切相关[25]，属水平上相对丰度前30的真菌有unclassified_f_Hypocreaceae和Fusarium与土壤碱解氮含量呈显著负相关，其中Fusarium是一类世界性分布的植物病原真菌，普遍存在于空气、土壤及植物残体中，可侵染植物的任何部位；且Fusarium寄主范围极广，能引起农作物、药用植物、观赏植物和饲用植物等100多种寄主发生穗腐、萎蔫、茎腐、根腐等病害，造成严重的经济损失[26]。常规施肥+高碳基土壤调理剂和常规施肥+高钙高镁型土壤调理剂的碱解氮含量明显高于常规施肥，碱解氮含量又与Fusarium呈显著负相关，所以施加土壤调理剂在一定程度上可以抑制Fusarium的生长，从而降低真菌型土传病害发生率。研究虽然揭示土壤调理剂对真群落多样性的影响，但未涉及具体的调控机理，这有待开展深入研究。