肾移植患者尿小圆上皮细胞阳性指标与BK 病毒尿症的临床相关性

许瀚仁 王继纳 杨 橙 张 潮 戎瑞明 朱同玉 许 明△

（1复旦大学附属中山医院泌尿外科 上海 200032；2上海市器官移植重点实验室 上海 200032）

肾移植术后BK 病毒（BK virus，BKV）感染导致的BKV 相关肾病（BKV nephropathy，BKVAN）已成为移植肾功能丢失的重要原因之一[1］。BKV在人群中普遍易感，可潜伏在泌尿系统（尤其是肾小管）上皮细胞中。在免疫抑制状态，肾移植患者体内潜伏的BKV 被激活并进入肾小管上皮细胞的细胞核内进行复制，大量病毒释放到尿液中，引起BK 病毒尿症[2］。BKV 在血液中持续高载量表达可进一步损伤移植肾组织，导致肾小管萎缩和间质纤维化，最终形成BKVAN，而目前临床上对于BKVAN 尚无确切有效的治疗手段。

从BK 病毒尿症到BKVAN 是一个BKV 感染逐步进展的病程，目前临床上对BKV 感染进行免疫抑制剂减量干预的时机是BKV 血症或尿液中BKV-DNA 载量持续升高[3］。研究显示，BK 病毒尿症对BKVAN 的阳性预测值为27.3%，而BKV 血症则为54.5%[4］。虽然BK 病毒尿症对BKVN 的阳性预测值较BKV 血症低，然而却是BKV 在肾移植患者体内开始复制的初始阶段，如果能够在BK 病毒尿症的阶段即予以密切监测甚至及早干预治疗，将有助于控制BKV 感染进展到BKVAN。

目前临床上诊断BK 病毒尿症主要通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）来检测尿液中BKV-DNA 的载量，当尿液中BKV-DNA 载量＞107copies/mL 时诊断为BK 病毒尿症[5］。然而，目前国内绝大多数医院（包括作者所在的医院）在临床上并未常规开展BKV-DNA PCR 检测的项目，通常是器官移植科室的实验室或委托院外的检测公司开展此项检测业务，因而限制了这项检测的便利性。因此，如果能够利用临床上已经普遍开展的检测方法及指标来预测BK 病毒尿症，将有助于BK病毒尿症的早期诊断及病程监测。

肾小管上皮细胞在BKV 感染时的坏死和凋亡会引起炎症反应，损伤周围的正常肾小管上皮细胞并导致其脱落，形成临床尿常规检测报告中的尿小圆上皮细胞（small round epithelial cells，SREC）。SREC 细胞核小呈圆形，核膜厚，胞质内常见颗粒，与Decoy 细胞在形态上有明显差异[6］。 尿液中SREC 的检测方便易行，可以通过全自动尿沉渣分析仪检测，目前国内大多数医院已经在临床普遍开展，尿常规的项目中已包含SREC 的指标项。临床使用的尿沉渣分析仪有高度准确性、便利性，可大量筛查疑似患者的尿液标本。正常人的尿液罕见SREC，大量的SREC 常见于急性肾小管坏死和肾小管间质炎症的患者[7］。此外，肾病综合征、大量蛋白尿、肾移植术后1 周内或移植肾发生排斥反应，均可在患者的尿液标本中检测到SREC。肾移植术后1 周内，尿中可出现较多的SREC，随后可逐渐减少而消失。SREC 还常见于女性月经或是女性正常脱落细胞、尿路感染和肾炎肾损伤情况，主要以排除尿路感染的常见因素为主[8］。

本研究拟通过诊断评价方法探索采用尿常规中的SREC（即脱落的肾小管上皮细胞）指标来预测和辅助诊断肾移植术后BK 病毒尿症的可行性和准确性，为探索采用临床上已存在的、简便易行的方法来诊断、监测肾移植术后BK 病毒尿症提供新的思路。

资料和方法

临床资料回顾性分析2017年1月—2019年10月在复旦大学附属中山医院接受肾移植及随访的152例患者，随访截至2020年10月，患者随访时间最长为40 个月，最短为12 个月，平均随访时间为（18±6）个月。纳入标准：（1）行1 次及以上的尿液样本BKV-DNA 载量PCR 检测；（2）术后稳定长期门诊随访、行尿常规检测。排除标准：（1）年龄超过75岁或小于18岁；（2）移植肾功能丧失或伴有严重并发症。本回顾性临床研究方案经复旦大学附属中山医院伦理委员会批准（编号：B2019-320），所有受检者均签署了知情同意书。临床数据统计中包含肾移植患者的年龄、受者性别、免疫抑制方案、随访时间、HLA 匹配、血清肌酐、尿白细胞（urine white blood cells，UWBC）、尿 红 细 胞（urine red blood cells，URBC）、SREC 阳性指标、SREC 持续阳性时间段。本研究中所有肾移植患者术后均接受钙调磷酸酶抑制剂+麦考酚钠/吗替麦考酚酯+糖皮质激素的三联免疫抑制方案。

仪器与试剂UF-1000i 全自动尿沉渣分析仪及其配套的试剂和质控品均购自日本希森美康株式 会 社；7500 型 定 量PCR 仪（ 美 国Applied Biosystems 公司）；BKV 核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法，北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司）；OLYMPUS CKX31 倒置显微镜、OLYMPUS FLUOVIEW FV3000 激光共聚焦显微镜（日本奥林巴斯株式会社）；anti-BKV VP1（MAB3204-M02，一抗，亚诺法生技股份有限公司）；重组人细胞角蛋白18（Cytokeratin 18 antibody，CK18，ab668，一 抗），DyLight 488 Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（二抗），山羊抗小鼠IgG H&L（Cy3 ）（二抗，艾博抗上海贸易有限公司）；DAPI 染色液（上海睿宝和生物科技有限公司）；尿沉渣染色液（S-M 方法，珠海贝索生物技术有限公司）。

尿液标本收集和实验室检查尿液标本留取收集依患者随诊时进行。患者移植术后1 周、2 周，1、2、3、6、12、18、24 个月常规进行尿常规检测，以首次BKV-DNA 定量检测为观察期间的开始时间，观察两组患者在肾移植术后常规随访的尿常规化验单中SREC 阳性指标，出现SREC 指标阳性的起始时间点和结束时间点，并计算出时间段，将持续3 周及以上的持续阳性时间视为SREC 持续阳性时间段。其中有36 名患者在随访期间内BKV-DNA 载量＞1.0×107拷贝/mL，即纳入BK 病毒尿症组，101名患者在随访期间内BKV-DNA 载量＜1.0×107拷贝/mL，则纳入非BK 病毒尿症组。

尿沉渣涂片及S‐M染色留取肾移植术后BKV 感染患者的晨尿10 mL，1006.3×g离心5 min，取0.1 mL 的尿沉淀成分并均匀涂在防滑玻片，放置到倒置显微镜下加入尿沉淀染色液（S-M 染色）后观察。

尿沉渣免疫荧光染色收集肾移植术后BKVDNA 载量＞1.0×107拷贝/mL 患者的晨尿100 mL，1006.3×g离心10 min，倒出上清液，将底部沉淀物以同样条件再离心10 min，取0.1 mL 的尿沉淀成分加入4% 多聚甲醛后石蜡包埋切片，使用一抗anti-BKV VP1（1∶300）和一抗CK18（1：300）染色过夜，PBS 洗涤3 次，与适当的二抗IgG H&L（488）（1∶1000）和二抗IgG H&L（Cy3）（1∶1000）在室温下孵育1 h。PBS 洗涤3 次，将载玻片用抗褪色试剂和DAPI（蓝色）固定。

BKV‐DNA实时荧光定量检测实时荧光定量聚合酶链式反应检测肾移植患者尿液或者血液中BKV-DNA 载量是目前主要诊断BKV 感染的方法[9］。临床尿液和血浆标本送至荻硕贝肯临床检验实验室（上海）检测并出具检测报告，使用BKV 核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法，北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司）检测尿液中的BKV-DNA载量。 当尿液BKV-DNA 测定值≥1.0×107拷贝/mL 时定义为BK 病毒尿症，测定值的范围为2.0×103～5.0×108拷贝/mL，测定值＞5.0×108拷贝/mL 时，等同为5.0×108拷贝/mL。

尿流式细胞结果检测分析尿液标本留取收集依患者随诊时进行。患者移植术后1 天，1、2、6、9、12、18 周进行常规的尿常规检测，同时收集患者中段晨尿10 mL 分装2 管标本，送至中山医院检验科的UF-1000i 全自动尿液有形成分分析仪进行全尿液流式细胞学SREC 细胞定量指标的检测。观察两组患者在肾移植术后常规随访的尿常规化验单中SREC 阳性指标，出现SREC 指标阳性的起始时间点和结束时间点，计算出时间段，将持续3 周及以上的持续阳性时间视为SREC 持续阳性时间段。

统计学方法采用SPSS 22.0 统计分析软件。计量资料以±s表示，符合正态分布的资料采用t检验，偏态分布的资料采用Mann-Whitney U 检验，配对四格表数据比较两者相关性采用Kappa 检验。将影响因素和P＜0.05 因素纳入Logistic 回归模型计算预测肾移植术后出现BK 病毒尿症感染的独立预测因素，用ROC 曲线评估独立预测因素对于BK病毒尿症的诊断效能。P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

患者的一般临床资料本研究中BK 病毒尿症患者与非BK 病毒尿症患者在年龄、性别、免疫抑制方案、随访时间、血清肌酐、尿白细胞和尿红细胞的差异均无统计学意义，尿小圆上皮细胞阳性及其持续阳性时间段差异有统计学意义（表1）。

表1 肾移植患者病例资料Tab 1 The clinical data of kidney transplant recipients[±s or n（%）］

表1 肾移植患者病例资料Tab 1 The clinical data of kidney transplant recipients[±s or n（%）］

CsA：Cyclosporine A；Tac：Tacrolimus；MMF：Mycophenolate mofetil；Pred：Prednisolone；HLA：Human leukocyte antigen；SREC：Small round epithelial cell；DSRECP：Duration of SREC positivity.

Item Sex（males/females）Age（years）Follow-up duration（years）Scr（μmol/L）Postoperative immune suppressive regimen CsA+MMF+Pred Tac+MMF+Pred HLA match number URBC（+/-）UWBC（+/-）SREC（+/-）DSRECP（+/-）BK Viruria（n=36）25/1143.33±12.402.83±1.20176.63±12.8612（33.3）24（66.6）4（4，4）14/227/2934/234/2 non-BK Viruria（n=166）81/3540.78±11.393.03±1.37170.06±10.6236（31.1）80（68.9）4（4，4）66/5021/9544/7217/99 P 0.9650.4390.8350.3750.7950.2930.4700.230＜0.001＜0.001

SREC 持续阳性时间段预测BK 病毒尿症从临床数据分析，SREC 阳性指标与BK 病毒尿症有明显相关性，阳性预测值为68.97%，阴性预测值为72.68%；而多次检测出的SREC 持续阳性时间段与BK 病毒尿症也有相关性，阳性预测值为94.44%，阴性预测值为85.34%（表2）；单次和多次检测的SREC 持续阳性时间段与BKV 血症无明显特异性，阳性预测值为11.60%，阴性预测值为98.10%。根据SREC 持续阳性时间段的出现与BK 病毒尿症确诊的时间节点进行比较，SREC 持续阳性时间段能提前（1.5±0.5）个月预测BK 病毒尿症的发生。

表2 BK 病毒尿症和多种检测指标的预测效果Tab 2 The correlation between BK viruria and multiple clinical indicators （%）

尿SREC 中BKV 颗粒的鉴定本实验在BK 病毒尿症患者尿沉淀涂片直接观察可见SREC 与Decoy 细胞同时存在，S-M 法染色后细胞形态有明显的差异（图1、2）。尿沉淀制成的石蜡切片免疫荧光结果显示，VP1 仅在SREC 的细胞质和Decoy 细胞的细胞核上表达，证明SREC 有BKV 感染，与Decoy 细胞同为BK 病毒尿症的诊断依据（图3）。本研究同时将不同BKV-DNA 载量、SREC 定量值的尿沉淀切片进行免疫荧光染色处理，再用Image J软件分析图片，从该结果可推测SREC 的数量是与尿液BKV-DNA 载量呈正比，而当尿液BKV-DNA载量越大，SREC 内存在BKV 颗粒的细胞比例越高（图4）。

图1 BK 病毒尿症患者的尿沉渣细胞涂片（镜下，40×）Fig 1 Urine sediment cell smear of patients with BK viruria disease（light microscope，40×）

图3 BK 病毒尿症患者免疫荧光染色的尿沉渣切片（40×）Fig 3 Immunofluorescence staining for the BK viruria patient’s urine sediments sections（40×）

图4 不同时间节点BKV‐DNA 载量的BK 病毒尿症患者免疫荧光染色的尿沉渣切片（5×）Fig 4 Different BKV‐DNA loads of the BK viruria patient’s urine sediments tissue sections at various time points（5×）

尿SREC 持续阳性时间段预测BK 病毒尿症的Logistic 回归模型分析考虑到SREC 与尿液中存在的影响因素的相关性，使用URBC、UWBC、SREC 阳性指标和SREC 持续阳性时间段与BK 病毒尿症作Logistic 回归分析。结果显示，BK 病毒尿症与SREC阳性指标和SREC 持续阳性时间段有明显相关性，而与URBC 和UWBC 无明显相关性，这两项指标对于SREC 和SREC 持续阳性时间段的预测效能没有影响（表3）。此结果证明SREC 持续阳性时间段与BK病毒尿症的相关性最佳。SREC 阳性指标同样与BK病毒尿症显著相关。

表3 BK 病毒尿症相关Logistic 回归分析Tab 3 Logistic regression analysis of BK viruria

图2 BK 病毒尿症患者的尿沉渣涂片（S‐M 法染色，40×）Fig 2 Urine sediment smear of a patient with BK viruria（S‐M method staining，40×）

尿SREC 定量指标与尿液BKV‐DNA 定量指标成正比线性关系将BK 病毒尿症患者术后1 天，6周、9 周、12 周定期检测的SREC 定量指标和BKVDNA PCR 定量指标进行长期多次对比观察，发现在不同患者的相同随访周期内，SREC 与BKV 载量存在相似的变化趋势且成正比关系，SREC 每增加1个/μL，BKV-DNA PCR 定量指标约增加1.1×108拷贝/mL，反之亦然。将SREC 定量指标与当日患者的尿液BKV-DNA 载量做Logistic 线性回归模型分 析。 117 份SREC 定量 指标中，与BKV-DNA 的载 量 的 线 性 系 数 为1.1×108（95%CI：7.81×107～2.5×108，P=0.0004），由此可知SREC 的定量指标与高BKV-DNA 载量呈正相关。BK 病毒尿症患者尿液样本的SREC 定量指标和BKV-DNA 定量PCR 指标能拟合出一趋势线，此结果证明SREC 的定量指标与BK 病毒尿症的高BKV-DNA 载量有线性正相关（图5）。

图5 小圆上皮细胞定量值与BK 病毒尿症患者BKV‐DNA载量的Logistic 线性回归分析Fig 5 Logistic linear regression analysis of SRECs and BKV‐DNA load in patients with BK viruria

尿SREC 持续阳性时间段与BK 病毒尿症的ROC 曲线本研究的肾移植患者术后发现BK 病毒尿症的中位数时间在2.5 个月，而BK 病毒尿症患者在术后（1.0±0.5）个月检测到SREC 阳性指标，根据SREC 持续阳性时间段的出现与BK 病毒尿症确诊的时间节点进行比较，SREC 持续阳性时间段可能提前（1.0±0.5）个月预测BK 病毒尿症的发生。

根据Logistic 回归分析的结果，以SREC 持续阳性时间段来预测BK 病毒尿症，AUC 为0.872，95%CI：0.77～0.974，cut-off 值为85.5 天，对BK 病毒尿症有临床预测价值（图6）。此结果证明尿SREC持续阳性时间段预测BK 病毒尿症发生的效能较佳，可很好降低术后BK 相关肾病的发生。

图6 尿小圆上皮细胞持续阳性时间段预测BK 病 毒尿 症的ROC 曲 线Fig 6 ROC curve analysis of urine DSRECP for predicting BK viruria infection

讨论

BKV 的感染在健康人群中普遍存在，成年人中BKV 血清抗体阳性可达到90%[5］，平时在泌尿系统的肾小管上皮细胞和尿路上皮细胞里休眠潜伏。由于正常人群免疫功能正常，绝大多数被感染者终生不会出现BKV 感染的临床症状。肾移植患者处于免疫抑制状态，休眠状态的BKV 可发生复制、增殖，导致BKV 感染。国内文献报道肾移植术后BK病毒尿症、BKV 血症和BKVAN 的发生率分别是45.6%、22.2% 和5.6%[10］。如果可以早期预测及诊断BKV 感染，则可以密切监测并及时进行干预，从而降低BKVAN 的发生率，提高移植肾的长期存活率。

据国外文献报道，肾移植术后BK 病毒尿症主要发生在术后1～3月，从BK 病毒尿症进展至BKV血症及移植肾损伤有4～12 周的窗口期[11］。国内的报道显示，肾移植术后BK 病毒尿症多发生在术后2个月左右[4］。本研究也发现，肾移植患者BK 病毒尿症主要发生在术后（2.5±0.5）个月，而SREC 持续阳性时间段能提前（1.5±0.5）个月预测病毒的发生。根据2019年版美国移植学会的临床建议，尿液细胞学检测只有Decoy 细胞阳性才能诊断为肾移植术后多瘤病毒感染，在肾移植术后每2 周进行一次尿液细胞学检查Decoy 细胞直到术后3 个月。而对尿BKV-DNA 载量检测是术后每个月1 次，直到术后9 个月，再每3 个月检测一次直到术后2年[3］。

通过尿液细胞学检查寻找Decoy 细胞，需要经验丰富的技术人员，而且主观性较强，临床上应用有较大局限性。基于PCR 方法的尿液BKV-DNA载量检测是目前临床常用方法，但是检测过程相对比较繁琐，而且大多数医院未常规开展，对患者而言频繁检测也增加了医疗支出。如果能够利用目前临床上尿常规检测项目中的某些指标，来早期预测甚至诊断BK 病毒尿症，将有助于密切随访BKV的感染病程，从而有针对性地指导BKV 血症和BKVAN 的检测及监测。SREC 指标在临床上多出现于肾脏的急性肾小管坏死、肾小管间质炎症、尿路细菌感染、肾病综合征和移植肾排斥等，在BKV感染方面未见文献报道。已有研究证实，潜伏在尿路上皮中的BKV 增殖性感染可导致肾小管上皮细胞核损伤、细胞破碎溶解，细胞内过氧化氢酶释放过氧化氢氧化各类细胞器碎片[12］，释放大量炎症因子导致周围正常肾小管上皮细胞脱落，进而从尿液中排除。然而，尚未有研究对SREC 与BKV 感染的相关性进行研究和报道。

本研究以医院检验科的尿常规结果为数据，研究全自动尿沉渣检测仪检测SREC 指标用于临床预测BK 病毒尿症。由于全自动尿沉渣检测仪可以大量、准确地测出尿液中的细胞指标，而且尿常规项目是肾移植患者术后常规的检查项目，应用此临床指标诊断BK 病毒尿症能提供更加便捷、经济实惠的无创临床诊断方案。

我们的研究发现，SREC 阳性指标、定量指标、持续阳性时间段均与BK 病毒尿症有明显的相关性。双重免疫荧光标记法和S-M 尿沉淀染色法同时证明SREC 细胞质内存在BKV 颗粒，且在该细胞核内未发现BKV 颗粒，由此可知SREC 与Decoy 细胞并非相同细胞类型，而且与BK 病毒尿症有直接相关性。由此可得出：（1）SREC 持续阳性时间段的指标能提前1 个月预测BK 病毒尿症的发生；（2）如果SREC 阳性指标持续的时间在85 天左右，预测BK 病毒尿症的效能最佳，阳性预测值为100%；（3）SREC 在BK 病 毒 尿 症 中 同 样 感 染BKV，与Decoy 细胞来源自相同的脱落肾小管上皮细胞，可能为潜在的早期Decoy 细胞的形态；（4）即使混杂了与SREC 相关性较高的尿液干扰因素，也不影响SREC 持续阳性时间段对BK 病毒尿症的诊断效能；（5）SREC 的定量指标与BK 病毒尿症的BKV 载量有正比关系，此研究结果可进一步探究SREC 指标诊断BK 病毒尿症的优化方案。

综上所述，肾移植患者SREC 阳性指标可预测早期BKV 感染的发生，SREC 阳性时间段在预测BK 病毒尿症方面的准确性更高，可能为本研究中最优化的辅助诊断早期BKV 感染的临床指标。

本研究结果尚有不足之处，如病例数不足、缺乏前瞻性研究设计、指标的特异性尚未在其他研究中验证过，仍需进一步深入研究。

作者贡献声明许瀚仁 探索研究方向，数据采集，论文撰写和修订。 王继纳 论文构思和指导，实验设计，数据分析。杨橙 实验设计，实证与验证数据分析在临床上的可行性。张潮 数据统计和分析，模型运算，修订论文。戎瑞明 论文审阅和指导。 朱同玉 论文框架设计，调整研究计划。许明 论文修订和终审。

利益冲突声明所有作者均声明不存在利益冲突。