粮油食品防霉微生物筛选及其活性物质初步研究

郭 超，韩 伟，任 菲，王 超✉

（国家粮食和物资储备局科学研究院，北京 100037）

根据FAO估计，每年至少有2%的粮食因霉变而不能食用。我国粮食每年因霉变造成的损失占总产量的 1.5%～3%[1]。真菌及其真菌毒素污染是威胁粮食储藏运输流通环节安全、造成粮食损失的主要因素之一，许多真菌能引起粮食变色、发热，同时产生大量的真菌毒素。我国每年因真菌及真菌毒素污染造成的粮食减产、浪费和安全风险，不仅使得国民的身体健康受到威胁，还直接影响我国的粮油食品安全[2-4]。目前解决粮食霉变的途径可分为物理、化学、生物三类。物理方法主要包括气调储藏、低温储藏、微波以及纳米氧化锌、纳米银等的吸附作用；化学方法主要是利用丙酸、山梨酸、双乙酸钠、苯甲酸等酸类物质及其盐[1,5-7]。生物学方法主要有利用生物来源的具有防霉功能的活性物质，如香辛料、中草药等植物中提取的精油，具有抑菌性能的活性物质主要为醛类、酚类、酯类和醇类[8-10]；来源于动物的壳聚糖、鱼精蛋白等[11-12]；目前见报道的产生防霉活性物质的微生物主要有链霉菌属（Streptomyces)、芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas putida）、根霉属（Rhizopus）、木霉属（Trichoderma）等[7]。

芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）于 1945年即被发现其代谢物具有抑菌活性[13]，因具有稳定性好、抗逆性高、抑菌谱广等优点，其产生的大量抗菌化合物已应用于食品加工和作物保护领域，如食品防腐剂、治疗剂和生物农药[14]。有效成分包含芽孢杆菌的防霉菌剂产品有普滤仕日本九州的日本鬼粉、湖北省武汉天惠公司的枯草芽孢杆菌、山东泰诺药业的木霉菌蜡质芽孢杆菌泰诺-维克等[7]。枯草芽孢杆菌类成员包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）等。其产生的抑菌物质根据其生物合成途径和化学性质可区分为非核糖体途径合成的脂肽类抗菌肽、核糖体途径合成的蛋白类抗菌物质以及挥发性化合物[15-17]。

本研究以禾谷镰刀菌（F. graminearum）为指示菌，筛选产防霉活性物质微生物，得到防霉活性较高的7株芽孢杆菌，初步确定活性物质为肽类，本研究结果为新型防霉剂开发提供了菌株来源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

待筛菌种及常见指示霉菌：国家粮食和物资储备局科学研究院筛选和保藏。

1.1.2 培养基

肉汤培养基（LB培养基）：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉 5 g/L，NaCl 10 g/L，115 ℃灭菌 25 min；

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA固体培养基）：马铃薯浸出粉 10 g/L，葡萄糖 20 g/L，121 ℃灭菌 25 min。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株培养

菌株活化：菌株接种于 LB液体培养基，接种量1‰，30 ℃、200 r/min震荡培养。

菌株培养：活化培养24 h后接种于LB液体培养基，接种量 1‰，30 ℃、200 r/min 震荡培养。

1.2.2 防霉活性筛选

禾谷镰刀菌菌块放置于PDA固体平板中间，30 ℃培养24 h。平板上等距离放置3～4个圆形滤纸片，滤纸片滴加10 μL待测样品后30 ℃培养。平板培养48～72 h后，采取十字交叉法测定抑菌圈直径。以抑菌圈直径大于30 mm判定为防霉效果强，以抑菌圈直径处于20～30 mm之间判定为防霉效果中等，以抑菌圈直径处于10～20 mm之间判定为防霉效果弱，以抑菌圈直径小于10 mm判定为没有抑菌效果。

1.2.3 菌种鉴定

1.2.3.1 形态观察 LB平板上划线分单菌落，观察单菌落形态；取菌液制片，10×100倍镜下观察显微形态。

1.2.3.2 生化反应鉴定 采用梅里埃芽孢杆菌鉴定试剂盒进行生化反应鉴定。

1.2.3.3 16S rDNA 基因序列比对 测序结果由美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站进行Blast比对，再使用MEGA5.1软件，采取邻接法（Neighbor-Joining法）构建系统发育树，可靠性检验bootstrap法。

1.2.4 抑菌谱的测定

采用打孔法，指示菌禾谷镰刀菌菌块放置于平板中间，30 ℃培养24 h，其余霉菌（灰绿曲霉Aspergullus glaucus、黄曲霉A. flavus、亮白曲霉Aspergillus candidus、黑曲霉A. nige、赭曲霉A.ochraceus、青霉Penicilliumsp.和产黄青霉P.Chrysogenum）调整孢子液浓度约为107cfu/mL后吸取 100 μL 涂布于打孔平板上。将菌液 4 000 r/min离心10 min，向孔中加入100 μL上清液后静置，直至上清液被吸收，30 ℃培养。平板培养48～72 h后，测量抑菌圈直径。

1.2.5 培养时间对防霉活性的影响

菌株按照方法1.2.1进行培养，不同时间段取样测量 OD600吸光度值并以禾谷镰刀菌为指示菌，查看抑菌效果。

1.2.6 活性物质分析

菌株按照方法1.2.1培养后，离心取上清液分别进行热处理、蛋白酶K处理及耐酸碱性实验，采用打孔法查看防霉效果，指示菌选用禾谷镰刀菌。热处理：在2 mL离心管中加入1 mL上清液，于50、75和100 ℃处理60 min，对照为未经处理的上清液；蛋白酶K处理：在2 mL离心管中加入900 μL上清液和100 μL 10 mg/mL蛋白酶 K，37 ℃处理60 min，对照为未经处理的上清液和以同样方法处理的蛋白酶K；耐酸碱性：取10 mL上清液分别调节 pH至 2、4、6、10、12，30 ℃静置 1 h 后 4 000 r/min 离心 10 min，取上清液调节pH至8.6，用0.22 μm滤器过滤，对照为未调节pH的过膜上清液。

1.3 数据分析

数据处理采用 Origin 2018、Mega5.1、Excel等软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 菌株防霉效果筛选

对菌种库中自酸菜、青贮饲料、老面馒头、玉米种植田地土壤等环境分离保存的364株细菌进行防霉效果筛选（见表1）。由表1可知，近50%的菌株具有防霉活性，其中抑菌圈直径大于20 mm的菌株占 38.47%。将初筛防霉活性强的 33株菌进行复筛验证后选取活性较高且稳定的7株菌，编号分别为 ASAG 62、ASAG 112、ASAG 2ME6、ASAG 2MF8、ASAG 2MD10、ASAG M6 和 ASAG M9。

2.2 菌种鉴定

所选菌株在LB平板上培养24 h后菌落形态如图1所示。ASAG 62菌落直径2 mm左右，菌落整体表面光滑，凸起；ASAG 112菌落较小，直径1～1.5 mm左右，边缘不规则，整个菌落表面有褶皱状凸起；ASAG M6、ASAG M9和 ASAG 2MD10形态相近，菌落直径2～3 mm，边缘清晰光滑，边缘有环状凸起，环状凸起中间凹陷；ASAG 2MF8菌落直径2～3 mm，边缘不规则，表面不光滑有黏液，菌落中间有少许褶皱状凸起；ASAG 2ME6菌落直径1～1.5 mm，中间有凸起，表面不光滑有黏液。在10×100倍下观察7株菌均为短杆菌。

图1 菌落形态（A）和显微形态（10×100倍，B）Fig.1 Colony morphology (A) and microscopic morphology (10×100 times, B)

采用梅里埃芽孢杆菌鉴定试剂盒对 7株菌进行生化反应鉴定，部分结果如表2所示。7株菌的%ID接近100，T值大于0.4，有意义的分类单位均被归类为枯草/解淀粉芽孢杆菌。区别主要集中于能否利用D-木糖、D-蜜二糖、D-棉子糖、淀粉与糖原。

表2 生化反应鉴定结果Table 2 Identification results of biochemical reactions

为进一步确定种属，将7株菌16s rDNA序列经 Blast比对。结果显示，其与贝莱斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）、暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）、解淀粉芽孢杆菌等芽孢杆菌属菌株Query covery达到 99%以上。选取芽孢杆菌属模式菌株构建系统发育树，结果显示，该 7株益生菌与贝莱斯芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌在同一分支上，与解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌也具有极高的亲缘性（见图2）。贝莱斯芽孢杆菌因与解淀粉芽孢杆菌具有极高的相似性而被认为是解淀粉芽孢杆菌的同物异名，于2016年由Dunlap等[16]认定其在细菌命名法中的分类地位。暹罗芽孢杆菌又译为西姆芽孢杆菌，于2010年被收录为有效种名[17]。

图2 菌株与芽孢杆菌属模式菌株16S rDNA基因系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of the screening strains and type strains of Bacillus sp.

2.3 培养时间对防霉活性的影响

通过绘制生长曲线可知：7株菌在培养 17 h后进入对数期，29～41 h时菌株浓度达到最大值，其中 ASAG 62、ASAG 112、ASAG M6和 ASAG 2MD10生长较快，菌株浓度于培养29 h达到最大值且 OD600均高于 3.0；ASAG M9、ASAG 2ME6、ASAG 2MF8 相对缓慢，培养 41 h OD600最高，其中ASAG 2ME6与ASAG 2MF8菌株浓度相对较小，OD600低于 2.5（图3A）。以禾谷镰刀菌为指示菌，测定不同培养时间菌液上清的抑菌效果，发现进入对数期后抑菌效果显著增加，而菌株浓度达到最大值后，抑菌效果基本保持稳定，因此采用培养48 h的发酵液进行防霉实验（图3B）。

图3 培养时间对防霉活性的影响Fig.3 Effect of culture time on bacteriostasis of F. graminearum

2.4 菌株对粮油食品中常见霉菌的抑菌效果

取 7株高防霉活性菌株上清液采用打孔法对8种粮食中常见霉菌进行防霉实验，如表3所示。7株菌的活性物质对亮白曲霉和禾谷镰刀菌抑制效果最显著，能够完全抑制亮白曲霉的生长；ASAG 2MD10对青霉、禾谷镰刀菌的抑制效果最好，抑菌直径分别为19.0 mm和35.0 mm；ASAG 62对产黄青霉、黑曲霉、赭曲霉、黄曲霉抑制效果最好，对黄黄曲霉的抑菌直径为15 mm；ASAG 2ME6对灰绿曲霉抑制效果最好。

表3 筛选菌株对常见霉菌的抑制效果Table 3 Inhibition effect of screening strains on common molds mm

2.5 防霉活性物质初步分析

贝莱斯芽孢杆菌与暹罗芽孢杆菌均为枯草芽孢杆菌的近缘种，同样具有广谱抗菌性和高稳定性，主要抗菌活性物质为非核糖体合成的脂肽类抗生素[18-19]。通过对筛选所得7株菌上清液进行蛋白酶K处理后其防霉效果基本没有变化，而对照蛋白酶 K溶液对禾谷镰刀菌完全没有抑菌效果；进行不同温度处理发现100 ℃高温处理使防霉活性明显降低甚至消失，说明活性物质在高温下不稳定；经测定发现上清液pH位于8.4～8.8之间，酸性环境下上清液产生沉淀，离心后调节pH至8.6，通过防霉实验发现在pH6～10之间除ASAG 112外其它6株菌具有防霉活性，初始pH条件下防霉活性最高，酸碱度影响防霉活性，初步推测其活性物质为肽类物质（见图4）。

图4 蛋白酶K、温度及pH对防霉活性的影响Fig.4 Effect of different treatment (A Proteinase K, B Temperature, C pH) on anti-mold activity

3 结论

本研究通过对大量菌株进行筛选得到7株防霉活性较强的菌株，均与贝莱斯芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌具有较近的亲缘关系，初步归属为芽孢杆菌属。绘制生长曲线并测定不同时间上清液的抑菌活性，确定培养时间为48 h。活性物质不易被蛋白酶K分解，不耐高温，耐受pH范围为6～10，初步分析为肽类物质。其中ASAG 62对常见霉菌，尤其是高毒霉菌黄曲霉具有一定抑菌活性。下一步拟对 ASAG 62、ASAG 2MD10 和 ASAG 2ME6菌株进行发酵液的复配研究，进一步提高防霉效果、扩大抑菌谱，寻找新的推广途径。

备注：本文的彩色图表可从本刊官网（http://lyspkj.ijournal.cn）、中国知网、万方、维普、超星等数据库下载获取。