兰花组织培养研究进展

穆玉珍，朱美瑶

（重庆师范大学生命科学学院，重庆沙坪坝 401331）

兰科植物种类繁多，约有700 属20000 种，分布辽阔，多生于温带和亚热带地区。其姿态优美，花色淡雅，花香清幽，被誉为“花中君子”，再加上历来文人墨客吟诗作赋，赋予了兰花高洁傲岸的文化形象，使得兰花颇受人们喜爱，具有极大的观赏价值，同时也具备一定的商业价值。此外，部分兰科植物也可入药，有着极高药用价值。然而在自然条件下，兰花生长周期过长，且其无性和有性繁殖存在许多困难，因此很难进行大量繁殖和生产。近年来随着社会的发展和人们生活水平的提高，人们对兰花这类观赏植物的需求也日益增大，而传统的兰花繁殖与生产方式难以满足需求。兰花组织培养技术能够缩短培养周期，提高繁殖系数，不受季节影响，同时降低了生产成本，可以在短时间内通过无性繁殖大量生产兰花。

目前的研究对象多集中在蝴蝶兰、蕙兰、春兰、墨兰、君子兰、建兰等，学者们就外植体的选择、培养基配方、褐化现象等进行了深入研究，为工业化生产和保护濒危种类奠定了技术基础。

1 外植体的选择

目前，对兰科植物组织培养的研究，选择的外植体多为某些特定部位，具有一定的局限性。通过对兰花不同外植体的研究，能够扩大兰花组织培养的材料范围，减少对母株的伤害。兰花的种子、叶片、根尖、花梗、茎尖、子房、花萼、花丝等都可作为外植体。兰科植物的种类、外植体的选择不同，试验结果会存在一定的差异。

1.1 种子

兰花蒴果中的种子数量众多，但种子细小，胚发育不完整且无胚乳，种皮结构致密，在自然环境下不易萌发。种子的非共生萌发是生产兰花杂交花苗的重要方式，具有广阔的研究前景，同时也是一个技术难点。Bernared[1]早在1909 年，将卡特兰（Cattleya）与雷丽兰（Laelia）的杂交种子接种到培养基中，成功进行了非共生萌发，开创了非共生萌发的先例。种子非共生萌发的试验体系也在不断的试验研究中逐渐形成。试验中通常取蒴果进行消毒，在无菌条件下剖开蒴果，取出种子播种到培养瓶中。不同时期的蒴果萌发率不同。有试验表明，春兰种子作为外植体时，授粉后8～9 个月的种子萌发率较高，而墨兰的种子在3～5 个月时容易萌发[2-3]。预处理也可以提高种子的萌发率，研究者对种子进行1min 的超声波处理，种子萌发率达到20%；用蜗牛酶处理2～3min，种子萌发率可达70%以上[4]。

1.2 叶片

叶片也可作为组织培养的材料，其取材对母株的伤害不大，受季节影响较小。一般选取试管苗幼嫩的叶片，其更容易诱导原球茎，而成熟植株的叶片诱导成功的研究较少，多发生褐化死亡。杨美纯等[5]研究发现，叶片正面向上放置时，诱导率更高，且对叶片进行切割，更利于切割边缘诱导出原球茎，切块应大于0.5cm×0.5cm，否则容易褐化死亡。

1.3 花梗

花梗常作为外植体材料，在多种兰科植物中皆有运用，如蝴蝶兰、大花蕙兰、文心兰等，国兰以花梗作为外植体的研究较少，多集中在种子、茎。通过对石斛兰的研究发现，用带有节间的花梗进行诱导，会出现大部分死亡，从而使诱导效率较低[6]。花梗的取材受到季节影响，通常不同时期的花梗诱导率也不同。有试验发现，开花后的花梗比开花前幼嫩的花梗更容易诱导出芽[7]。具体的原理还有待探究。

1.4 茎尖

茎尖是最早用于兰花组织培养的外植体，早在1960 年，Morel[8]采用大花蕙兰的茎尖，诱导分化出了植株。但茎尖的切取会对母株造成较大伤害，而且在茎尖的培养中，容易出现褐化现象[9]。茎尖多选用幼嫩的部分作为材料，其细胞分裂旺盛，是组织培养的重要材料。同时茎尖的大小、部位也是重要影响因素，一般认为带有1～2 叶原基的茎圆锥成活率高，中间部位的侧芽成活率高。茎尖的诱导率也与接种方式有关。在对文心兰的研究中发现，茎尖竖直接种诱导率更高[10]。

1.5 其他外植体

根尖也能用于组织培养，洋兰中有成功的案例，但国兰的报道较少。花丝也可作为外植体，其不易染菌，材料易得，一般选取未绽放的花蕾进行消毒处理。邢桂梅等[11]成功用君子兰的花丝诱导出愈伤组织，并发现活性炭对花丝愈伤组织的诱导和分化有抑制作用。

2 消毒方式

消毒是否彻底将直接影响试验的成功率，通常用到的消毒试剂有酒精、升汞、次氯酸钠、过氧化氢等。升汞为剧毒物质，次氯酸钠具有氧化性且无毒，可代替升汞，但升汞的消毒效果优于次氯酸钠。高壮壮等[12]将蝴蝶兰花梗用2%过氧化氢消毒10min，再用10%次氯酸钠消毒15min，达到的效果与0.1%升汞消毒效果无明显差异，以此方式代替升汞消毒具有重要意义。在消毒过程中，消毒剂的浓度、消毒的时间以及外植体的保存时间等，都会直接影响外植体的消毒效果。一般用75%的酒精消毒30～45s，0.1%的升汞消毒5～8min，10%的次氯酸钠消毒20min[13]。有试验发现，外植体现取现用时污染率最小，随着时间增加，污染率增加，当保存时间超过7d 时，污染率最大，达到100%[14]。不同的外植体的消毒方式有所差异。种子一般选用蒴果进行消毒处理，若选用种子直接进行消毒，则不可用75%酒精消毒，可选用2%次氯酸钠溶液消毒6min[15]。花梗、茎等消毒完毕后，需将其与消毒剂接触部分切除，所以消毒前外植体要切取足够的体积。

3 防止褐化的方法

褐化是在组织培养过程中，外植体中的酚类物质被氧化成了褐色的醌类物质，抑制了其他酶的活性，从而导致外植体发生褐变死亡的现象。褐化与多种因素有关，如外植体的选择、取材时间、大小、生理状态，培养基成分、培养条件以及试验预处理等。研究发现，蝴蝶兰带腋芽的花梗要比不带腋芽的褐化程度低，花梗的褐化程度低于花萼[16-17]。一般认为处于生长旺盛期的外植体，其褐化程度更小。与PVP 相比，活性炭是非专一吸附剂，不仅会吸附酚类物质，还会吸附其它植物组织生长所需要的物质，因此会影响外植体生长和诱导，而PVP 也因不同外植体产生的酚类物质有所差异，而效果不同。通过对蝴蝶兰的研究表明，在含有1%Vc溶液培养皿中，切取茎尖，再将茎尖接种到含有0.2%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的培养基中，可以减少褐化发生[7]。研究发现，活性炭抑制褐化效果较Vc 高[18]。热激处理也可以减小褐化程度。试验发现，40℃热激9min，并结合0.1%水杨酸处理，能有效抑制蝴蝶兰的褐化[19]。在初期培养中，进行一段时间的暗培养，能降低褐化率，但时间过长会影响生长。在对春兰褐化的防控中，发现暗培养10d 的褐化率最低，暗培养20、30d的褐化率迅速升高[17]。当外植体发生褐化后，可切除褐化部分，将健康部分转入新的培养基中，以防止褐化。

4 基础培养基

在国内学者的研究中，兰花组织培养所采用的基础培养基一般为MS 和VW，其中VW 培养基一般用于培养气生兰花。例如，有试验证明，最适宜蝴蝶兰花梗生长的培养基配方为MS 培养基，而适宜蝴蝶兰根培养的培养基为1/2 MS 培养基[20]。在君子兰的培养过程中，诱导生根多用1/2 MS 培养基，诱导四倍体形成和愈伤组织形成多用MS 培养基[21]。在墨兰以胚诱导原球茎的形成过程中，1/2 MS 的效果最好，在花芽和茎尖诱导原球茎形成的过程中，以MS 培养基培养效果最佳[3]。还有学者通过正交试验得出MS 对墨兰根状茎分化率的影响显著，当MS 含量由小到大逐渐增加时，对墨兰根状茎分化率的影响效果为先减小后增大[22]。

5 植物生长调节剂

植物生长调节剂可影响和有效调控植物的生长和发育，一般由人工合成的或从微生物中提取，其生理和生物学效应与植物激素相似，在兰花的组织培养中有着重要作用。在兰花组织培养中，常用的植物生长调节剂有6-BA、NAA、2，4-D、IAA，不同种类、不同浓度的植物生长调节剂对兰花的生长和诱导会起到不同的作用。有试验表明：6-BA 对蝴蝶兰花梗腋芽的萌发具有明显的促进作用，且在一定浓度范围内，随着6-BA 浓度的升高，花梗侧芽分化率逐渐提高[23]。而在胚诱导原球茎试验中，6-BA 的浓度低于0.5mg/L 时对胚萌发无明显影响，高于0.5mg/L 时起抑制作用；NAA 浓度在低于0.5mg/L 时随着浓度的增加对胚萌发的促进作用逐步增强，超过这个浓度也会起抑制作用[3]。在墨兰种子无菌萌发的正交试验中发现，R（NAA）＞R（6-BA）＞R（MS），即NAA 对墨兰种子发芽率的影响效果最大，6-BA 次之，MS 最小[22]。也有试验表明，2，4-D 在愈伤组织的形成及分化方面有积极作用，NAA 在拟原球茎分化方面也有重要的作用[24]。在关于文心兰的有关试验中发现，培养基中添加TDZ 有利于诱导花梗芽转化为营养芽[25]。

6 天然植物成分

在兰花的组织培养中还可选择性地添加一些天然植物组织成分，如香蕉泥、马铃薯匀浆、椰乳等，对兰花的生长也能起到促进作用。有试验表明：在培养基中添加10%香蕉汁液较适合大花蕙兰组培苗的诱导生根[26]。在大花蕙兰原球茎增殖及芽苗分化试验中，香蕉泥促进效果最好[9]。在蝴蝶兰组织培养体系的研究中发现，添加土豆泥或香蕉泥的培养基分化、生长状况均较好，分化率都可达到90%以上[23]。

7 展望与讨论

植物组织培养技术是目前发展较为成熟的现代生物技术之一，也是重要的基础研究手段之一。兰科植物生长周期长，在自然环境中繁殖慢，运用组织培养技术可以实现兰科植物的快速繁殖，以满足市场所需。此外，在兰花组织培养过程中，产生的次生代谢物有药用价值。如君子兰中含有的抗病毒和抗癌的物质，这些物质无法在体外合成，次生代谢产物的研究也是组织培养的重要方向。种子的无菌萌发也有重要意义，是杂交品种培育的唯一方式，为兰花优良性状的选择提供了技术基础。兰花的组织培养加快了兰花的工业化生产，为基因转化提供了材料，为保护珍稀品种奠定基础。但兰花组织培养在实际的操作中仍存在不少难题，如组织培养过程中褐化、次生代谢物的污染、染菌等问题，都会给兰花组织的生长以及诱导分化造成不利影响，因此，兰花组织培养体系与流程仍需进一步探索与完善。目前生物科学发展较为迅速，可结合生物化学、细胞生物学、分子生物学等，在兰花的组织培养方面进行更为深入的研究。总之，兰花组织培养技术有广阔的发展前景及较高的实用价值。