药用植物中3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶的研究现状与展望

张贵翔，吴连花，吴友根*，杨东梅，于 靖，张军锋

（1 海南大学园艺学院，海南海口 570228；2 湖南省衡阳市中心医院）

3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A 还原酶（HMGCR）存在于所有的真核及原核生物中，在植物中，HMGCR 都是由1 个多基因家族编码的，组成每个多基因家族的基因数量在不同的植物中是不同的[1]。自20 世纪90 年代起，许多学者发现特定物种中HMGCR的mRNA 表达模式不同，表明了编码的酶可能参与了类异戊二烯的生物合成，且这些酶的功能多样性可能与亚细胞位置的差异有关[2]。随着研究的深入，逐渐发现HMGCR 是与许多药用植物活性成分合成相关的MVA 途径（甲羟戊酸途径）中的第1 个关键酶，其可以催化 3-羟基 -3-甲基戊二酸单酰辅酶 A（HIMG-CoA）生成甲羟戊酸（MVA），该反应是不可逆过程，是萜类物质合成的第一个限速步骤和重要调控点[3]。有学者通过研究真菌诱导烟草细胞悬浮培养液，以此方式生物合成倍半萜类物质，结果表明，如果很快增加HMGCR 的活性，则倍半萜环化酶活性增强，与此同时相应的活性物质产量也会增加，这表明了萜类物质代谢合成途径与HMGCR 调控密切相关[4]。

HMGCR 是限速酶，在催化HMG-CoA 合成甲羟成酸的过程中，需要NADP 的协助，同时也能够受洛伐他汀抑制剂的特异性抑制，是MVA 生物合成途径中最重要的步骤[5]。研究表明，HMGCR 基因家族在植物和其他生物中有非常高的保守性，因此该家族是作为开发萜类物质合成代谢过程中的一个关键生物元素[6]。随着代谢途径中关键酶基因如HMGCR、MVAK、DXP、DXR 等的研究，使得萜类物质合成的代谢工程转化为现实产业成为了可能。HMGCR 作为植物体内重要代谢物质通路上的关键调控点，已成为越来越多的学者研究植物代谢的关键酶之一[7]。研究药用植物中HMGCR，可为进一步开发利用药用植物的商业价值，开拓更广阔的市场提供借鉴。

1 HMG-CoA 还原酶的催化机制

1.1 HMG-CoA 还原酶的结构特征

研究表明，植物HMGCR 亚型都具有相似的结构组织，表明了共同的进化起源，该蛋白的一级结构中界定了4 个区域：N 末端（N-terminal region）、连接区（linker region）、跨膜区（membrane domain）以及C 末端催化域（catalytic domain）[8]。跨膜区及C 末端在植物的HMGCR 中具有高度保守性，而N 端和连接区在长度和氨基酸序列上都有显著的差异性。植物HMGCR 序列的5'端主要编码形成N 末端区域，而3'则形成大约由400 个氨基酸残基组成且具有高度保守性的C 末端催化域，除此之外，植物的HMGCR 结构还包括一部分开放阅读框区域（ORF），用于翻译编码蛋白[9]。并且，HMGCR 的蛋白质序列具有4 个高度保守的基序，它们存在于所有植物的HMGCR 催化区域中，即2 个HMG-CoA 结合结构域序列 EMPIGYVQIP 和TTEGCLVA 以及2 个NADP（H）结合结构域DAMGMNM 和GTVGGGT，这也反映了功能域在分子进化中具有很高的稳定性[10]。

1.2 HMG-CoA 还原酶的催化反应

HMGCR 在细胞液中进行催化反应，HMG-CoA 通过利用两分子的NADPH 并经过2 个连续的氢化物的转移还原裂解为甲羟戊酸。整个催化反应分为3 个步骤，第1 次通过一分子的NADPH 还原形成mevaldyl-CoA 半缩硫醛中间体，该中间体随后分解为高分子聚乙醛和CoAS-，然后被质子化，第2 个NADPH 随后替代NADP+将聚乙醛还原为甲羟戊酸[11]。因HMGCR 复杂的催化机制，其过程具体受哪些物质的调控还有待进一步的研究。有学者发现，茉莉酸甲酯可以使HMGCR 基因表达量提高，从而增加相关次生代谢物质的合成。适量浓度的茉莉酸甲酯能够明显增加紫杉细胞悬浮液内紫杉醇的含量[12]；茉莉酸甲酯诱导的露水草悬浮细胞培养中20-羟基蜕皮酮是空白组含量的8 倍[13]。此外，水杨酸、Ag+等都可以影响HMGCR 基因的转录水平[14]。以此类物质为基础，结合植物类异戊二烯代谢途径的生物特性，可为进一步研究HMGCR 的催化机制提供基础。

2 药用植物中HMGCR 基因的克隆研究

在生物界中，尽管对HMGCR 基因的克隆方法可包括保守区设计引物扩增、同源序列筛库、功能互补、直接法克隆[15]，但目前绝大多数在植物HMGCR 基因克隆试验中均采取第1 种方法，即采用保守区设计引物，通过RT-PCR 及RACE 技术来克隆目的基因全长。许巧仙[16]通过RACE 法分别对甘草HMGCR 基因5'和3'端进行克隆，然后拼接出cDNA 全长，得到甘草HMGCR 基因，全长1842bp，预测包含一段完整的开放阅读框（ORF）长度为1722bp，编码574 个氨基酸，与苜蓿、烟草等植物具有高度同源性，并且具有HMGCR 基因典型的底物结合位点；Liu 等[17]在三七的转录组数据中发现了一个注释到HMGCR 的转录本，根据ORF 设计引物克隆基因得到三七的HMGCR 基因全长1690bp，编码563 个氨基酸，存在2 个跨膜区分别分布在35-37 和78-100 的氨基酸内；郭思远等[18]克隆到雷公藤HMGCR 基因编码区的全长序列，共1770bp，编码589 个氨基酸，根据生物信息预测发现其被定位在叶绿体，有跨膜域，并含有4 个功能结构域，与不同物种进行同源比对发现相似度较高，表明具有较强的保守性。除此之外，还有诸如青蒿[19]、牛樟芝[20]、茅苍术[21]、阳春砂[22]等很多药用植物的HMGCR 基因被克隆出来，通过利用生物信息学分析、功能验证等手段进一步开拓了这些植物的利用价值。

3 药用植物中HMGCR 调控及基因组织特异性研究

3.1 HMGCR 在生物合成途径中的调控

MVA 途径是一种在高等真核生物中都可以发现存在的途径，甚至在许多病毒体内也存在着此途径，虽然某些植物、原生生物顶复门的生物及大多数微生物（如结核杆菌和某些病毒）可以通过另一种途径合成IPP 和DMAPP，但甲羟戊酸途径的代谢产物作为类萜等的生物合成过程中的前体，是植物体内的生产代谢中重要的单位[23]。植物中甲羟戊酸途径是一个不可逆的过程，而HMGCR 作为这条甲羟戊酸代谢途径上的第一个限速酶，被认为是影响此途径代谢水平的关键酶，具有调控作用，许多萜类等次生代谢产物的生物合成都与HMGCR 有关[24]。尽管HMGCR 的调控机制十分复杂，但都包括2 个主要的方面，即反馈抑制调控和交叉调控，分别受甲羟戊酸途径和不同的生化途径作用影响酶的活性。迄今为止，HMGCR 的活性在植物中调控作用的研究主要集中在转录水平，HMGCR 的mRNA 转录水平可被许多诱导因子所影响。除了上述提及的影响因子之外，一些物理因素如光、机械伤害，生物因素如病菌感染，化学因素Ca2+等都可以从转录水平有效调控HMGCR 的活性及表达[25]。

3.2 药用植物中HMGCR 组织特异性研究

随着实时荧光定量PCR 技术在植物中的应用，其灵敏、简便、特异性高等特点可以实时监测整个PCR反应，使对特定区域的扩增产物的定量和定性成为现实[26]。对基因在不同部位的表达量研究可以对药用植物中有关的活性物质的分布有更表观的认识，为药用成分的研究、分子验证等提供更快捷、准确的方向[27]。Wang 等[13]从露水草的芽培养物的细胞悬浮培养物，克隆并鉴定了编码HMGCR 基因的cDNA 全长，根据qRT-PCR 结果发现HMGCR 在茎、根、叶片中较为丰富。而刁秀楠等[28]通过对大豆8 个HMGCR 基因家族的成员组织特异性研究发现，尽管8 个基因在根、茎、叶中均有表达，但同一基因在不同部位以及不同基因在同一部位都显示出差异性；孟想想等[29]测定了罗马洋甘菊花、茎、根和叶中HMGCR 的表达量，在各个组织中均检测到了HMGCR 基因的存在，花中相对表达量最多，茎中最少。

4 HMGCR 基因功能分析研究进展

酶动力学研究是衡量基因功能的重要手段之一，通过酶和底物结合的能力以及对反应催化的速率可以判断所克隆基因编码的酶是否具有催化活性的重要依据[30]。在植物HMGCR 酶动力学研究中，当反应酶和底物结合能力的Km 值越大时，表明酶与底物的结合能力越弱，其催化能力也就越小，反之越大[31]。

4.1 HMGCR 酶动力学研究

Bach 等[25]开发了一种利用Brij W-1 对从黄化萝卜幼苗中分离的重膜组分HMGCR 进行增溶的方法。通过硫酸铵沉淀、基于蓝色葡聚糖琼脂糖及HMG-CoA 己烷琼脂糖的色谱分析的方法纯化已被溶解的酶，然后用于研究其分子和动力学性质。数据显示，萝卜中HMGCR 的Km 值为1.5μM，对应于NADPH 的值为27μM，是迄今为止药用植物中HMGCR 活性研究较高的结果。然而这种纯化方法易出现去污剂可溶解的膜蛋白的异常沉淀问题，即经硫酸铵饱和离心后发现其漂浮在溶液顶部。尽管可以使用大量的二硫赤藓糖醇和只使用新配制的缓冲液可以保护酶免受氧化，但阴离子交换色谱很不利于酶表现活性。

4.2 HMGCR 体外重组表达

随着对体外重组表达的研究越来越多，高效的细菌表达系统和简单的纯化程序被越来越多地应用在酶蛋白的研究当中[32]。其中，大肠杆菌作为一种代谢活跃、培养简便、遗传稳定的原核生物，是目前科研中应用最为广泛的表达系统之一[33]，具有处理简单、费用低、表达高效、用途广泛、质粒拷贝数高的优点，在蛋白表达系统中具有良好的利用价值。

20 世纪90 年代，有学者将拟南芥中HMGCR 亚型1 的催化域在大肠杆菌中催化活性形式表达并纯化，获得了大量的纯化酶，最终的比活也高达17U/mg，这比当时从任何植物源纯化的HMGCR 所报道的活力都要高[34]。梅抗抗[15]克隆了油橄榄HMGCR 基因，构建原核表达载体在大肠杆菌中成功表达，并使用TPTG诱导，SDS-PAGE 检测，结果表明重组蛋白分子量均在66.2kDa 以上，经分离纯化后进行酶促反应验证蛋白功能。由于在HMGCR 酶促反应中反应产物甲羟戊酸容易内酯化形成甲羟戊酸内酯，所以一般通过甲羟戊酸内酯的形成及含量来衡量HMGCR 体外催化活性。上述研究中由于在试验组反应产物中检测到了甲羟戊酸内酯，而对照组则未见，证实了HMGCR 体外催化活性。

4.3 HMGCR 体内表达研究

除此之外，由于HMGCR 是植物甲羟戊酸途径中起调控作用的关键酶，其酶基因在植物体内的上调对提高下游代谢物质的含量有重要的调节作用。根据转基因研究显示，HMGCR 基因的过表达可显著提高酶的转录活性，提高类异戊二烯物质含量[35]。

将含有在超级启动子控制下克隆的HMGCR 基因的pBIB 质粒载体用于橡胶胚性愈伤组织进行遗传转化，并通过Northern 印迹杂交，半定量PCR 和qRT-PCR 分析鉴定了HMGCR 基因的过表达，结果发现，相对于对照植株来说，HMGCR mRNA 转录物的积累在转基因植株中更丰富。而且还发现在转基因植物中光合色素、蛋白质含量和HMGCR 酶活性水平也相继增加。另外，与对照相比，在所有转基因植物中乳胶产量显著增加[36]。王家典等[37]通过Gateway 克隆技术、基因枪介导等方法，把HMGCR 的ORF 连接到正义表达载体中，然后转入雷公藤悬浮细胞以过表达雷公藤HMGCR 基因研究其对雷公藤内酯和雷公藤红素生物合成的影响。检测结果显示，目的基因的相对表达量在过表达组显著提高，是对照组的1.75 倍，而雷公藤内酯和雷公藤红素含量在过表达组中提高了160%以上，证实了HMGCR 在雷公藤生物合成途径上对萜类物质的正向调控效果。

另外，HMGCR 基因的异源表达及共表达也是当今研究的热点方向之一，为研究物种间的同源性及充分利用基因在次生代谢产物合成生物途径中的不同作用提供试验基础。在青蒿中，过表达长春花的HMGCR基因和青蒿中的amorpha-4、11-diene 合酶（ADS）基因，并使用hptII 基因探针评估转基因再生子形成的转基因品系的整合和转基因拷贝数。通过Southern 印迹和RT-PCR 证实了转基因的整合，表明了HMGCR 和ADS 在转录水平上的表达。研究结果发现，转基因品系的青蒿素含量比非转基因植株高7.65 倍[38]。

5 结语

HMGCR 是倍半萜类化合物合成过程中最先起作用的关键酶，对下游的次生代谢物质的合成具有紧密的调控作用：倍半萜类物质的合成与HMGCR 活性成正相关。HMGCR 是一个多基因家族，其基因家族成员的差异表达，对甲羟戊酸代谢/碳流的调控起重要作用，决定了各种萜类最终产物的比例。而在药用植物中，大部分活性成分都来源于此代谢途径，由HMGCR紧密调节，运用基因挖掘手段，结合分子功能验证工具来充分发挥HMGCR 的生物功能可为增加药用植物的利用价值提供不可估量的前景。

然而尽管是同一物种的同一基因，但序列和结构仍可能会存在差异性，品种、环境、部位差异等都可能是导致这些不同的因素。这为包括HMGCR 在内的各种酶蛋白可操作调控生物代谢途径提供了多种可能性。药用植物在医药中因其栽培手段、成本因素、利用价值等在医药行业的发展过程中占有重要地位，而其资源的保护及开发利用也因此受到国家和行业研究人员的高度重视，包括植物化学分类方法的进一步应用在寻找和扩大药用植物的新资源的方面发挥了重要作用。加上现有的先进育种手段、组织培养等，药用植物的开发迎来前所未有的机遇。然而要从根本上提高药用植物有效成分的含量，必须了解相关次生代谢产物合成的机制，相应调控其分子途径。对HMGCR 等酶蛋白的研究，不仅可节省植物生产成本，而且能开发更大的商业价值。