Robos在神经精神疾病中的研究进展

黄唯 综述 徐忠祥 审校

遵义医科大学附属医院神经内科，贵州 遵义 563000

Robo是由SEEGER等[1]最先于1993年从黑腹果蝇中克隆得到，是一种与发育相关的跨膜蛋白，与其配体Slit结合在神经系统发育中起重要作用。Robo家族有4名成员，Robo1蛋白为神经细胞黏附分子家族成员之一，其结构包括由5个免疫球蛋白(immunoglobulin，Ιg)样序列和3个Ⅲ型纤维连接蛋白(fibronectin typeⅢ，FNⅢ)结构域组成的胞外区、跨膜区和4个保守的Robo特异性序列CC0-CC3组成的胞内区[2]。Robo2、Robo3与Robo1相比，有相似的胞外区，但胞内区缺乏CC2、CC3序列[3]。Robo4胞外域的排列方式与所有其他Robo家族成员的排列方式明显不同，其胞外区只有2～3个Ιg样序列 和2个FNΙΙΙ，胞内区缺少CC1和CC3[4]。研究发现Robos蛋白参与神经轴突和树突定向生长、神经细胞迁移及外周神经修复等生理病理过程[5-7]。在多种神经精神疾病的发病机制中起重要作用。故本文就Robos在相关神经精神疾病中的研究现状进行综述，以期为其发病机制及治疗提供新的理论依据。

1 Robo1调控神经轴突导向及细胞迁移

Robo1在神经轴突导向方面具有非常重要的作用，主要是维持腹部轴突导向以阻止其穿越中线[8]。其机制可能是Robo1与Slit2结合引起肌动蛋白细胞骨架重组调节肌动蛋白丝聚合和细胞迁移[9-10]。另外GTPase活化蛋白(GAPs)、Cdc42也参与Robo1/Slit介导的中线排斥，Robo1与Slit2结合在体内减弱ADP-核糖基化因子4A(Arl4A)-Robo1的相互作用，从而减弱Cdc42介导的细胞迁移[11-12]。

1.1 神经胶质母细胞瘤 神经胶质母细胞瘤是一种预后较差的原发性脑肿瘤[13]。以往有很多研究表明Robo/Slit信号通路在肿瘤细胞的增殖、迁移、血管生成等过程中起重要作用[14]。有研究发现Robo1在不同级别胶质母细胞瘤中mRNA和蛋白质水平上均呈高表达，并且Robo1/Slit2信号传导通过Cdc42-GTPase失活抑制瘤细胞迁移和侵袭[10]，其可能成为神经胶质母细胞瘤防治的潜在靶标[15]。NGUEMGO KOUAM等[10]研究发现，胶质母细胞瘤细胞系U-373 MG和U-87 MG的迁移能力与Robo1和Slit2存在相关性，Robo1或Slit2高表达可降低迁移相关蛋白的表达，从而抑制瘤细胞的迁移。最近一项研究表明，Robo1-CAR-NK92细胞对神经胶质母细胞瘤和胶质瘤细胞具有很强的靶向杀伤作用[16]。另外小分子RNA也参与了Robo1在胶质母细胞瘤中的作用，microRNA-218降低Robo1表达抑制胶质母细胞瘤的迁移和侵袭[17]，miR-219-5p负性调控Robo1表达抑制瘤细胞增殖和侵袭并诱导其凋亡[18]，值得注意的是，在越高级别肿瘤组织中Robo1的表达越高，而microRNA-218与之相反，提示临床治疗中调控Robo1表达水平至关重要[19]，并且现已有研究将Robo1列为神经胶质母细胞瘤基因治疗的一个靶标[20]。在此基础上深入研究Robo1在胶质母细胞瘤中的作用机制,可为今后胶质母细胞瘤的诊断、靶向治疗及预后提供全新的诊疗思路。

1.2 阅读障碍 阅读障碍是一种常见的学习障碍，其病因涉及神经生物学和遗传学[21]。HANNULA-JOUPPΙ等[21]研究发现Robo1是阅读障碍的易感基因之一，Robo1可通过调节胼胝体的纤维轴突生长和纤维结构发育等微结构来影响人的阅读能力[22]。由于Robo1基因编码产物可导向树突及轴突的生长[2]，故有研究人员推测Robo1基因编码异常能对神经轴突造成影响，导致中枢神经发育异常而致病[23]。另有研究表明转录因子Lhx2是Robo1的负调控因子，Lhx2通过调节Robo1的表达参与丘脑发育，其缺失影响丘脑内侧膝状体纤维投射，从而导致听觉皮层区域的受损影响阅读[24]。此外发现阅读障碍易感性单倍体内的三种新型变异体，可能是Robo1基因的低表达致病的原因[24]。

1.3 脊髓损伤 脊髓损伤后功能恢复的关键是促进轴突分支生长，研究发现Robo1/Slit2信号是参与增强轴突再生及重建神经元回路的关键通道，Robo1、Slit2、RhoA可定位于脊髓的同一神经元中，Slit2通过抑制Robo1下调RhoA表达，从而刺激轴突分支生长来改善脊髓的功能恢复[25]。另外，通过脊髓内注射RNAi慢病毒敲除Robo1也可以改善受损脊髓的功能[25]。因此，在涉及脊髓损伤中是否可通过调节Robo1的表达来恢复脊髓功能，提高患者的生活质量具有潜在的研究价值。

2 Robo2介导神经轴突导向及调控多巴胺能系统功能

Robo2是指导背部轴突导向的主要受体[8]，其既可促进Slit在神经中线的排斥作用，也可抑制Robo1/Slit信号的排斥作用而促进轴突穿越中线[24]。另外，Robo2/Slit2信号通路控制着下行多巴胺能纵向轴突的侧向定位和正确导向[26]。

2.1 周围神经损伤 研究发现，切断背根神经节的轴突可以改变Robo/Slit基因的表达，Robo/Slit主要受提供营养支持的靶组织的影响，外周神经损伤后Robo2/Slit1可诱导受损初级感觉神经元的再生，并可促进断裂背根神经节神经元的生长[7]。另外，小鼠坐骨神经损伤后在脊髓运动神经元和背根神经节的感觉神经元中检测到Robo1-2 mRNA、Slit1-3 mRNA的表达，并且在损伤的第4～14天Robo1和Robo2在坐骨神经残端轴突再生中表达，而Slit3是再生过程中神经桥和远端神经残端表达的主要配体，提示Robo/Slit3信号通路在周围神经修复中起关键作用[27]。

2.2 精神分裂症 中脑多巴胺系统由中脑腹侧被盖区和黑质致密部组成，对运动功能、动机、奖赏、学习和记忆至关重要，并且中脑腹侧背盖区与认知和心理活动的精神行为存在一定关联[28]。研究发现，Robo1和Robo2在多巴胺能神经元的形成中起重要作用，且可能不依赖与slit结合[29]。Robo2在中脑腹侧被盖区高表达，且对于维持腹侧被盖区中的抑制性突触至关重要，在小鼠实验中，Robo2失活后自发性抑制性突触后电位频率降低[30]。GORE等[30]证实在腹侧被盖区，Robo2失活会增强多巴胺作用，导致大脑兴奋性和抑制性神经递质系统失去平衡，这可能是精神分裂症的发病机理。并且已有研究鉴定出Robo2是精神分裂症的易感基因之一[31]。

3 Robo3基因突变及其对神经轴突的影响

Robo3可竞争性抑制Robo1与Slit的结合，消除Robo1对神经中线的排斥作用，促进轴突穿越中线[32]。Robo3在中脑、小脑和脊髓回路中广泛表达[33]。

3.1 水平注视麻痹伴进行性脊柱侧弯(horizontal gaze palsy and progressive scoliosis，HGPPS) HGPPS是一种罕见的先天性疾病，为常染色体隐性遗传，其特征是在儿童期或青春期出现眼球水平运动受限和进行性脊柱侧弯[34]。值得注意的是，HGPPS患者具有脑干发育异常和脑干神经元通路交叉的缺陷[35]。遗传研究证实，HGPPS的发病机制与Robo3基因突变有关，Robo3通过阻断轴突对排斥性Slit受体的反应来允许神经中线交叉，这种作用机制决定了脑干神经轴突交叉以及由此产生的脑干形态变化[32]。目前为止，Robo3引起HGPPS的突变存在40余种，主要致病基因位于11q23-25号染色体上，该基因包含28个外显子，编码1386个氨基酸的跨膜受体蛋白，对轴突的引导和调控具有重要意义[36]。因Robo3基因突变导致脑干的神经通路交叉出现异常，故推测患者的水平注视麻痹可能与脑桥网状结构以及内侧纵束中发育的轴突不能穿过中线从而导致信号无法向外展神经传达有关[37]。关于脊柱侧弯方面的机制，目前认为Robo3突变通过改变配体识别或蛋白质折叠来影响蛋白质功能变化，对神经纤维束的形成发展或对脊柱侧弯产生影响[38]。另外也有学者认为Robo3基因突变可能诱发病理性骨骼肌肉改变，从而促进脊柱侧弯[39]。此外神经源性机制学说认为脑桥网状结构中的下行脊髓纤维束与皮质脊髓束一起，介导从大脑到脊髓的控制信号，以驱动运动和调节肌肉张力[32]。综上所述，Robo3基因在脑干神经轴突中起重要作用，其突变会导致功能丧失，是HGPPS发生的关键因素。

3.2 自闭症(Autism) 自闭症是一种由神经精神发育障碍导致的疾病，主要表现为在儿童期就出现的社交障碍及一些机械的重复行为。自闭症的主要治疗靶点是5-羟色胺转运蛋白(SERT)，已证实果蝇中SERT的表达受到Robo2和Robo3的正调控[40]。通过对252个家庭的基因组分析，得到Robo3的四个内含子单核苷酸变异体(SNP)和Robo4的三个SNP与自闭症有关联[41]。Robo基因的异常可能通过干扰血清素能系统的功能或通过轴突导向受损影响神经发育[41]。自闭症发病机制中不仅只有Robo3介导，Robo1也参与其中。研究发现，自闭症患者大脑发育的特征是树突棘生长增加，其中硫酸肝素(HS)的缺乏对Robo1和Slit的结合过程有重要影响，Robo1与Slit之间的相互作用减少会降低Robo1中CC3与srGAP1的SH3的结合，最终导致肌动蛋白聚合增加，树突棘形成增加[41-42]。

3.3 癫痫 癫痫是由多种病因导致的脑部神经元高度同步化异常放电引起的临床综合征[43]。在颞叶癫痫大鼠模型中的研究发现，Robo3在癫痫模型慢性期表达降低，其Robo/Slit信号通路下游活化的srGAP会造成Rho GTPases失活，引起轴突的异常生长，从而使正常的神经网络遭到破坏[44]。另外，有研究认为Robo3可能参与了皮质发育过程中中间神经元的迁移和形态分化，而这些中间神经元的缺失会导致大脑兴奋和抑制失衡[45]。综上所述，Robo3可能通过调节神经轴突异常生长及神经元的兴奋和抑制失衡参与癫痫的发生。

4 Robo4在血管内皮细胞中作用

Robo4主要与调节内皮细胞功能和血管通透性有关，Robo4/Slit2信号通路对内皮细胞通透性的调控起重要作用[46]。Robo4在发育中的大脑广泛表达，可通过抑制Slit的排斥作用来调节新生大脑皮层中神经元的放射状迁移[47]。

研究认为脑损伤中血脑屏障的破坏加重脑水肿和神经功能障碍[48]。有研究证实Robo4与调节内皮细胞功能和血管通透性有关[49]，且Robo4/Slit2信号通路对内皮细胞通透性的调控起重要作用[46]。并可通过阻断血管内皮生长因子抑制血管生成[50]，Robo4在反应性星形胶质细胞中表达，可与Slit2结合后通过旁分泌或自分泌的形式参与星形胶质细胞的形态变化[51]，同时可通过抑制Robo1/Slit2通路减弱血管内皮生长因子作用，维持正常的血管通透性及内皮细胞迁移[52]。有研究显示缺血性脑卒中损伤早期Robo4和Slit2的表达即明显升高，且表达水平均为梗死侧大于非梗死侧，提示Robo4/Slit2可能参与卒中早期损伤后的保护机制[53]。Robo4的内皮稳定作用是通过下游的Paxillin24介导的，Slit2可能通过Robo4-Paxillin介导的Rac1激活部分稳定了内皮连接蛋白，从而降低了血脑屏障的通透性[48]。另外，脑损伤后通过Robo4-Paxillin依赖性的Rac1活化稳定紧密连接蛋白[54]，Robo4和Paxillin参与了Slit2激活Rac1的过程[55]。此外，Robo4/Slit2可通过抑制Src激酶磷酸化来干扰血管生成[56]。近年有研究发现膜联蛋白A2是Robo4配体，可调节Robo4-paxillin-ARF6信号传导，在维持血脑屏障功能方面起重要作用[57]。除了Robo4在缺血性脑损伤中的作用外，其它Robo亚型也参与了脑缺血损伤过程。有研究发现脑缺血损伤后神经保护作用可能是通过Robo1及Slit2表达增加来介导的，并且Robo1/Slit2信号通路可调节下游分子Rho GTPase以稳定细胞骨架，从而维持缺血脑细胞的功能、预防或减少突触和树突的破坏[58]。在小鼠缺血性脑卒中模型研究中，神经元中Slit1缺失或反应性星形胶质细胞中Robo2降低抑制神经母细胞向病变部位迁移，神经母细胞通过Robo2/Slit1信号传导及反应性星形胶质细胞增生迁移至病变部位，而由Robo2/Slit1信号介导的反应性星形胶质细胞增生中肌动蛋白细胞骨架的重排是其有效迁移的关键[55]。综上所述，Robo/Slit信号在缺血性脑血管疾病中的研究已成为热点，尤其是Robo4在血管内皮细胞的功能调节，有望成为缺血性脑血管疾病治疗的重要靶点。

5 展望

综上所述，Robos在神经精神疾病中的作用主要与其在轴突导向上的正确定位及引导有关，也与其和各种小分子受体结合后发挥作用紧密相关。目前研究的比较集中的是Robo1和Robo3，Robo1与神经胶质母细胞瘤的研究是个热点，可以从基因层面上为其治疗提供新的思路。Robo3基因突变的类型及新的突变是HGPPS的重点研究方向，其是否参与癫痫发生和发展仍需要进一步研究。Robo2在精神疾病方面未来或许有较大发展潜力。Robo4/Slit信号通路在新生血管方面的研究比较充足，可为缺血性脑血管病提供一些理论基础，未来也可为其治疗提供新思路。虽然目前对于Robos在部分神经精神疾病方面的研究已取得一定进展，但对于如何应用到临床诊断或治疗上还尚未实现，相信未来随着研究的不断深入，对Robos的研究会为神经精神疾病的临床诊断和治疗提供更充足的理论依据。