示差折光高效液相色谱法测定无糖食品中的异麦芽酮糖醇

2021-12-07

分析仪器 2021年6期

(上海市质量监督检验技术研究院，上海 200233)

随着食品工业的快速发展，以及人们对低热量和无糖食品的青睐。功能糖醇在食品领域的应用得到了迅猛的发展，目前市场上非常流行的含有功能糖醇无糖饮料、无糖糖果以及无糖糕点等，深受广大消费者喜爱。异麦芽酮糖醇是近年来国际上新型的功能糖醇，它作为蔗糖的替代品，由于其良好的理化性质、功能特点及口感，在无糖食品领域得到广泛的应用[1,2]。

异麦芽酮糖醇(Isomalt)又名帕拉金糖醇(Palatinitol)，亦称为益寿糖，由蔗糖用酶法转化为异麦芽酮糖后，经催化加氢而得的α-D-呋喃葡糖基-1，6-D-山梨糖醇和α-D-呋喃葡糖基-1，1-D-甘露糖醇混合物[3]。异麦芽酮糖醇化学性质极其稳定，不易吸湿，也不会发粘，在长时间高温时，其结构也不会改变[4,5]。如果将其晶体加热到熔点或将其水溶液加热到沸点以上，也观察不到其分子结构有所变化。具有分散性好，不粘结，易于包装、运输等特点。异麦芽酮糖醇味道温和，是一种新兴的食品添加剂，可为食品增加甜味和晶体结构。科学家和营养学家们发现，人体以及体内微生物对异麦芽酮糖醇的应答有许多方式，例如饱腹感、低胰岛素血反应、低消化性、低血糖反应、产生断链脂肪酸和益生菌等等[6-8]。食用异麦芽酮糖醇具有饱腹感，代谢没有负担，可减少高热量食物的摄入等优点，还具有降低能量值和维持血糖稳定的作用，作为糖的替代品，适量的摄入不但能够很好的控制体重远离肥胖，而且还可以降低一些疾病的发生，例如冠心病、糖尿病、高血糖等等[9,10]。异麦芽酮糖醇具有和其他食用糖醇(山梨醇、麦芽糖醇、木糖醇等)相类似的性质，如纯正的甜味、低热值、防龋齿糖尿病人可食用等[11,12]。异麦芽酮糖醇也具有很好的食品安全性，通过对其急性和亚慢性毒性研究，结果表明没有毒性和致癌性，也未见有致突变性及致畸性[13]。因此作为一种糖的代替品，异麦芽酮糖醇有着广阔的应用前景[14]。

目前针对异麦芽酮糖醇的研究，更多的是对其理化性质、制备工艺、产品用途以及食用是否健康安全方面做了大量的探索[15-21]。国内对于无糖食品中异麦芽酮糖醇的检测方法鲜有报道。因此，本实验建立了高效液相色谱通过示差折光检测器测定无糖食品中的异麦芽酮糖醇含量的方法，本方法可实现对无糖饮料、无糖糖果以及无糖糕点中异麦芽酮糖醇含量的分析测定。此方法灵敏度高、稳定性好，测定结果准确。

1 实验方法

1.1 仪器和试剂

Waters高效液相色谱仪(配备示差检测器)；万分位电子天平；超声波清洗器；涡旋混合器；离心机。

异麦芽酮糖醇标准品(纯度99%)；赤藓糖醇、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇标准品(纯度>98%，)；亚铁氰化钾、乙酸锌、三氯乙酸(优级纯)；乙腈(色谱纯)；三乙胺。

本实验所检测的样品均从超市购买。

1.2 溶液的配制

乙酸锌溶液：准确称取21.9g乙酸锌，加入冰乙酸3 mL，加水定容至100mL，溶解并混匀。

亚铁氰化钾溶液：准确称取10.9g亚铁氰化钾，加水定容至100mL，溶解并混匀。

三氯乙酸溶液：准确称取10 g三氯乙酸，加水定容至100 mL，溶解并混匀。

异麦芽酮糖醇标准储备液(50 mg/mL)：称取5.000 g(精确到0.001 g)异麦芽酮糖醇于100 mL容量瓶中，用水溶解并定容到刻度，4℃冰箱中可以保存2周。异麦芽酮糖醇标准工作液：分别吸取0.02 mL、0.04 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、1.0 mL、2 mL、4 mL异麦芽酮糖醇标准中间液于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，相当于0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、5.0 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL浓度标准溶液。

1.3 样品前处理

(1)无糖饮料

称取混合均匀的样品2.5g(精确到0.001 g)于50 mL具塞离心管中，加入30 mL水，涡旋1 min，下超声30 min，用水定容到50 mL，涡旋1 min，过0.22 μm(PTFE)微孔滤膜至样品瓶，供测定。

(2)无糖糖果

称取混合均匀的样品2.5 g(精确到0.001 g)于50 mL离心管中，加入30 mL水，涡旋1 min，室温下超声30 min，用水定容到50 mL，涡旋1 min，以9000 r/min离心2 min，过0.22 μm(PTFE)微孔滤膜至样品瓶，供测定。

(3)无糖糕点

称取混合均匀的样品2.5 g(精确到0.001 g)于50 mL离心管中，加入30 mL水，涡旋1 min，室温下超声30 min，缓慢加入亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液各1 mL，加水定容至50 mL，涡旋1 min，以9000 r/min离心2 min，过0.22 μm(PTFE)微孔滤膜至样品瓶，供测定。

2.2.3液相色谱分析条件

色谱柱为XBridge®BEH Amide 5 μm(4.6×250 mm)色谱柱，流动相A为乙腈-水-三乙胺(3∶1∶0.002,V/V/V)溶液，等度洗脱，流速为1.0 mL/min；进样量为20 μL；柱温为40℃；检测器为示差折光检测器。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

糖醇类易溶于水，因此前处理选择用水提取异麦芽酮糖醇。本实验采用XBridge®BEH Amide色谱柱对目标物进行分析，流动相中乙腈比例的多少直接影响分离效果，经多次试验，确定选择乙腈-水-三乙胺(3∶1∶0.002,v/v/v)溶液作为流动相，进行等度洗脱。在此条件下，异麦芽酮糖醇在14min左右出峰，其峰形较窄且具有很好的分离度，如图1，不会受到其他无糖食品中常见糖醇的干扰(例：赤藓糖醇、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇)，如图2所示，该方法对异麦芽酮糖醇的选择性很好。同时选择基质比较复杂的无糖糕点进行加标试验，如图3所示。从图谱中发现异麦芽酮糖醇具有很好的回收，该基质对异麦芽酮糖醇的分析检测几乎无影响，说明用该方法检测无糖食品中的异麦芽酮糖醇是可行的。因此，本实验以乙腈-水-三乙胺(3∶1∶0.002,v/v/v)溶液作为流动相。

图1 异麦芽酮糖醇标准溶液色谱图

图2 其他常见糖醇混合标准溶液色谱图

图3 空白样品和加标样品的色谱图

2.2 超声时间的优化

考察了不同超声时间对样品中异麦芽酮糖醇提取效率的影响，选择了相对复杂的无糖糕点作为基质，加入相同质量浓度的异麦芽酮糖醇标准溶液，分别选取了10 min、20 min和30 min作为低、中、高3个时间点。在相同条件下对异麦芽酮糖醇进行测定，结果如图4所示，不同超声时间异麦芽酮糖醇的提取率未发生明显的变化，故选择超声时间20 min作为提取时间。

另外，本实验还考察了超声温度对提取效率的影响。分别选取20℃、30℃、40℃这3个温度点，在同样的条件下对目标物进行测定，结果表明在这3种超声温度下，提取效率无明显差异，均能满足测定需求。因此，本实验对超声温度不做特别要求。

2.3 沉淀方式的优化

对于基质复杂的无糖食品，由于样品中含有难溶脂肪或者蛋白质等难以溶解的杂质，不能直接进样分析，需要除去杂质后再进行后续分析检测。基于此，实验分别考察了乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液(1∶1；v：v)、乙腈、三氯乙酸这3种沉淀方式对于样品中目标物提取效率的影响。称取3份无糖糕点，分别加入相同浓度的异麦芽酮糖醇标准溶液，按照上述方法进行处理，分别用乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液、乙腈、三氯乙酸溶液作为沉淀剂，结果如图5所示，表明采用乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液作为沉淀剂，异麦芽酮糖醇具有很好的回收率。因此，本实验使用乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液作为无糖糕点中沉淀杂质的方式。

图5 不同沉淀方式对异麦芽酮糖醇提取效率的影响

2.4 标准曲线与检出限

用去离子水将异麦芽酮糖醇的标准中间液配制成质量浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mg/mL的系列标准工作液，按色谱条件对上述标准溶液进行测定，以峰面积对质量浓度作标准曲线，其中以对应的色谱峰面积为纵坐标Y，待测组分的质量浓度为横坐标X，绘制标准工作曲线，经线性回归后求得相关系数。根据检出限的定义，以信噪比S/N=3为样品的检出限(LODS)，S/N=10为样品的定量限(LOQS)，结果如表1所示。

表1 异麦芽酮糖醇的线性方程

2.5 方法回收和精密度试验

选取3种有代表性的阴性空白样品基质(无糖饮料、无糖糖果、无糖糕点)，分别按低、中、高3个加标水平(10 g/kg、20 g/kg、50 g/kg)进行添加，每个添加水平做6个平行试验。然后在相同的处理和检测条件下测定回收率，检测结果如表2所示，加标回收率在93.0%～105.7%之间，相对标准偏差(RSD)小于3%。由此可见，本方法具有较高的准确性。