海南黑山羊肠道源乳酸菌的分离鉴定与生物学特性分析

汤 凯，杨劲松*，杨天澍，谭海生，字学娟，李 茂

（1.海南大学 食品科学与工程学院，海南 海口 570228；2.海南大学 材料科学与工程学院，海南 海口 570228；3.海南大学 林学院，海南 海口 570228；4.中国热带农业科学院 热带作物品种与资源研究所，海南 儋州 571737）

哺乳动物在刚出生时，其胃肠道微生物是一个极其复杂的系统，并且在不同物种甚至个体之间都有极大的不同[1-2]。乳酸菌是一种可发酵糖类物质、以乳酸为主要代谢产物的细菌，因其对人类有潜在的益生作用为人们广泛研究[3-5]。如今许多研究涉及乳酸菌的益生性，如乳酸菌与宿主肠粘膜相互作用而引起的免疫刺激和调节作用，以及提高宿主抗致病性渗透等功能[6-7]。乳酸菌在动物胃肠道系统中广泛存在，并且在维持动物健康和生长方面有重要作用[8]。

海南黑山羊历史悠久，品质优良，因其味道鲜美、口味独特以及膻味小等特点深受当地及两广地区消费者的喜爱[9]。黑山羊作为反刍动物，体内微生物种类丰富，焦金真等[10]研究了浏阳黑山羊胃肠道不同部位微生物数量的分布特征，结果表明瘤胃中微生物数量最多，盲肠、结肠、直肠居中，回肠次之，十二指肠和空肠最少。袁静[11]采用脉冲场凝胶电泳等技术构建黑山羊瘤胃未培养微生物BAC宏基因组文库，筛选到了纤维素酶克隆。张万昌等[12]从黑山羊瘤胃液中筛选到3株代表乳酸菌，分别是耐久肠球菌（Enterococcus durans）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）。

本研究从海南省澄迈县黑山羊小肠和直肠中分离、纯化乳酸菌，采用形态观察、生理生化试验和分子生物学方法进行鉴定，并探究其生长性能、产酸性能，酸、温度、盐耐受性能及对致病菌的抑菌能力，旨在筛选出优良的乳酸菌，为黑山羊的养殖提供良好的菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料和菌株

黑山羊小肠与直肠：海南省澄迈县黑山羊养殖场。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）：海南大学食品科学与工程学院食品生物技术实验室。

1.1.2 试剂

乙酸钠、磷酸氢二钾、氯化钠（均为分析纯）、二甲基亚砜（化学纯）：广州化学试剂厂。

1.1.3 培养基

MRS液（固）体培养基：广东环凯微生物科技有限公司；营养琼脂培养基、营养肉汤培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-17-D超净工作台：苏州佳宝净化工程设备有限公司；PHS-3E型精密pH计：上海雷磁仪器厂；MDF-382E型超低温冰箱：日本三洋电机株式会社；YM50FGN全自动高压灭菌锅：上海沪誉贸易有限公司；XSP-C204光学显微镜：重庆光电仪器有限公司；SKP-01电热恒温培养箱：湖北省黄石恒丰医疗器械有限公司；LC-LX-HR185高速冷冻离心机：桂林市仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分离

在无菌条件下分别吸取黑山羊小肠与直肠的肠道液，用无菌生理盐水进行梯度稀释，选取10-3、10-4、10-53个稀释梯度，各吸取100 μL涂布于含有1.5%碳酸钙的MRS固体培养基上，37 ℃厌氧培养48 h。挑取溶钙圈明显且较大的单菌落划线于MRS固体培养基上，37 ℃培养48 h，反复纯化多次，将纯化得到的单菌落在-80 ℃保存。

1.3.2 乳酸菌的鉴定

形态观察[13-14]：观察单菌落的色泽、形态、大小，并进行革兰氏染色实验和过氧化氢酶触实验，初步确定菌株是否为疑似乳酸菌菌株。

生理生化实验[15-19]：对所筛选的疑似乳酸菌进行葡萄糖产气试验、明胶液化试验、硝酸盐还原试验，以确定菌种种属的划分。

分子生物学鉴定：根据生理生化结果和形态学特征将菌株进行分组，并选取代表菌株送至华大公司进行测序，将测序结果提交至美国国家生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank数据库采用基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）进行比对搜索，选择序列同源性较高的菌株的16S rRNA基因序列，采用MEGA5软件中的邻接（neighborjoining，NJ）法构建系统发育树[20]，分析分离菌株与已知菌株的同源性。

1.3.3 生长曲线及产酸曲线的测定

将供试菌种以1%（V/V）的接种量接入MRS液体培养基中，每株供试菌做3组平行，置于37 ℃恒温培养，每隔2 h取样，测定各菌种发酵液的pH以及OD600nm值[12]，绘制产酸曲线和生长曲线[21]。

1.3.4 耐受性测定

将供试菌种以1%（V/V）的接种量接种于MRS液体培养基中，分别在5 ℃、10 ℃、15 ℃、45 ℃、50 ℃条件下培养48 h，观察生长状况。

将供试菌种以1%（V/V）的接种量接种于不同pH值（2.5、3.0、3.5、4.0、4.5和7.0）的MRS液体培养基中，37 ℃条件下培养48 h，观察其生长状况。

将供试菌种以1%（V/V）的接种量接入含不同NaCl含量（3.0%、6.5%）的MRS液体培养基中，37 ℃条件下培养48 h，观察其生长状况。

1.3.5 抑菌能力的测定

指示菌株的活化：将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌和沙门氏菌分别划线于营养琼脂培养基，37 ℃培养48 h。然后挑取单菌落接种于营养肉汤培养基中，37 ℃、180 r/min条件下培养24 h。将菌体浓度调整为1×107CFU/mL作为指示菌悬液。

上清液的制备：以1%（V/V）的接种量将乳酸菌种子液接种于MRS液体培养基中，37 ℃条件下静置培养12 h，10 000 r/min离心2 min后取上清液，4 ℃保存备用[22]。

牛津杯法测定抑菌性能[4，23-24]：向培养皿中倾注15 mL灭菌后的2%营养琼脂培养基，水平静置凝固后，接种100 μL指示菌菌液，涂布均匀后备用。用镊子将牛津杯垂直培养基表面均匀放置，牛津杯中加入100 μL乳酸菌上清液，4 ℃扩散2 h后37 ℃恒温培养24 h。根据抑菌圈直径大小判断菌株抑菌性能。抑菌圈直径＞7 mm时，判定为有抑菌作用。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的形态特征与生理生化试验结果

从海南黑山羊小肠和直肠中共分离得到32株有明显溶钙圈的菌株，革兰氏染色呈阳性，H2O2触酶试验呈阴性，初步确定为乳酸菌。菌株在MRS固体培养基上均呈现为圆形、中央凸起、表面光滑湿润、边缘整齐的白色小菌落。将乳酸菌菌株进行一系列生理生化鉴定试验，根据其形态特征和生理生化特性将32株菌株分成5类，分别为A类（8株菌）、B类（8株菌）、C类（6株菌）、D类（6株菌）、E类（4株菌），选取A类的代表菌株HCS6-1（细胞呈短杆状）、B类的代表菌株HCA6-2（细胞呈短杆状）、C类的代表菌株HCA5-3（细胞呈短杆状，成对存在）、D类的代表菌株HCS4-1（细胞呈椭圆状）及E类的代表菌株HCS4-3（细胞呈不规则的短棒状）进行进一步研究。5株代表菌株的生理生化试验结果见表1。由表1可知，5株代表菌株均不产气，明胶液化试验及硝酸盐还原试验均呈阴性。

表1 5株代表菌株的生理生化试验结果Table 1 Physiology and biochemistry test results of 5 representative strains

2.2 乳酸菌的分子生物学鉴定

5株代表菌株的系统发育树见图1，由图1可知，菌株HCS4-1、HCA5-3与发酵乳杆菌B35（GenBank登录号：LC094437.1）聚于一枝，亲缘关系最近，故将这两株菌株鉴定为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）。菌株HCS4-3与融合魏斯氏菌F213（GenBank登录号：MW035598.1）聚于一枝，亲缘关系最近，因此，将其鉴定为融合魏斯氏菌（Weissella confusa）。菌株HCS6-1、HCA6-2与植物乳杆菌BS16（GenBank登录号：JX968493.1）聚于一枝，亲缘关系最近，因此，将其鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。

图1 基于16S rDNA基因序列5株代表菌株的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of 5 representative strains based on 16S rDNA gene sequences

2.3 乳酸菌生长曲线的测定结果

5株代表菌株的生长曲线见图2。

图2 5株代表菌株的生长曲线Fig.2 Growth curve of 5 representative strains

由图2可知，5株代表菌株的生长趋势一致，迟滞期为0～4 h，菌株生长缓慢；4 h后进入对数生长期，菌种快速生长；到12 h后，进入稳定期，生长速率减缓；16 h后生长基本趋于稳定，整体趋向“S”型。由图2亦可知，相比其他菌种，菌株HCA5-3在对数期长势较快，菌株HCS6-1在对数生长期生长较平缓，达到稳定期后，菌株HCA5-3长势最好，菌株HCS6-1长势较差。

2.4 乳酸菌产酸曲线测定结果

5株代表菌株的产酸曲线见图3。

图3 5株代表菌株的产酸曲线Fig.3 Acid production curve of 5 representative strains

由图3可知，发酵2～8 h，5株代表菌株产酸量明显增加，在14 h后进入稳定期，产酸效率减小，20 h后产酸量基本保持不变，pH基本保持恒定，整体呈现“S”型。其中菌株HCS4-1较其他菌株产酸速率较快，菌株HCA6-2产酸能力较强。

2.5 乳酸菌耐受性测定

5株代表菌株的酸、温度及盐耐受性见表2。

表2 5株代表菌株的耐受性Table 2 Tolerance of 5 representative strains

由表2可知，在耐酸试验中，随着环境pH值的升高，菌种生长状况逐渐变好。当pH＜3.0之前，5株代表菌株均不能正常生长；当pH为3.5时，菌株HCS4-3生长微弱，其他代表菌株不能正常生长；当pH为4.0时，菌株HCA6-2不能正常生长，其他代表菌株均能微弱生长；当pH＞4.0之后，5株代表菌株均生长较好。在耐温试验中，所有菌株在5 ℃、50 ℃环境不能正常生长，菌株HCA6-2、HCA5-3和HCS4-3在45 ℃时生长良好，耐高温能力较强，菌株HCA6-2、HCS4-3在10 ℃环境下可以微弱生长，有较好的耐低温能力。在耐盐试验中，所有菌株在3.0% NaCl和6.5% NaCl环境下长势较好，耐盐性能优良。结果表明，菌株HCS4-3耐酸性（pH为3.5）较好；菌株HCA6-2、HCA5-3和HCS4-3耐高温（45 ℃）能力较强，菌株HCA6-2、HCS4-3耐低温（10 ℃）能力较强；所有菌株耐盐性能较好。

2.6 乳酸菌抑菌能力的测定

5株代表菌株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌的抑菌能力见表3。

表3 5株代表菌株的抑菌能力Table 3 Antibacterial activity of 5 representative strains

由表3可知，5株代表菌株对致病菌的抑菌圈直径均＞13 mm，抑菌效果明显。其中，菌株HCA6-2对大肠杆菌的抑菌效果较好，显著高于其他菌株（P＜0.05），菌株HCA5-3对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌的抑菌效果较好（P＜0.05），显著高于其他菌株。

综上，菌株HCA5-3、HCS4-1、HCA6-2在生长、产酸、耐受性以及抑菌性能方面表现优良，后续可作为黑山羊饲料添加剂应用到青贮饲料以及畜牧养殖中[25]。

3 结论

本研究从海南省澄迈县黑山羊小肠与直肠中共分离到32株乳酸菌，根据菌株形态及生理生化试验结果将32株乳酸菌归为5类，从中选取5株代表菌株进行分子生物学鉴定。经鉴定，2株为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum），2株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），1株为融合魏斯氏菌（Weissella confusa）。5株代表菌株中，菌株HCA5-3长势较好，菌株HCS4-1产酸速率较快，菌株HCA6-2产酸能力较强。耐受性试验中，菌株HCS4-3可以在pH 3.5环境下生长，耐酸能力较好；菌株HCA6-2、HCA5-3和HCS4-3在45 ℃环境下生长良好，耐高温能力较强，菌株HCA6-2、HCS4-3在10 ℃环境下可以生长，耐低温能力较强；5株菌株在6.5% NaCl环境下长势基本较好。在抑菌试验中，5株代表菌株对致病菌均有抑制作用，其中，菌株HCA5-3对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌有较好的抑制作用，菌株HCA6-2对大肠杆菌有较好的抑菌效果。