DAF rs150046210遗传变异与老年结直肠癌易感性关系研究

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是世界第三大常见恶性肿瘤，全球范围内每年大约有80万人死于CRC[1]，严重威胁人类的健康。恶性肿瘤的发生发展与补体调节蛋白(complement regulatory protein，CRP)参与的免疫逃逸机制有着十分密切的关系[2]。在肿瘤组织上高表达的CRP与肿瘤抵抗补体介导的肿瘤杀伤机制有关，并且可使肿瘤逃避机体免疫攻击[3]。衰变加速因子(decay-accelerating factor，DAF)作为重要的CRP，在多种肿瘤中高表达[4-5]，且与不良预后有关[6]。核苷酸多态性不仅是影响人群肿瘤易感性的重要因素，也是揭示肿瘤异质性的原因之一。鉴于DAF在恶性肿瘤发生发展中的重要作用，本研究通过检测可能影响DAF基因表达和功能的单核苷酸多态性在CRC病人和正常对照组中的分布情况，探讨DAF遗传变异与老年CRC发病风险的关系，为CRC病因探索提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 本研究经华北理工大学伦理委员会批准并与所有入组病人签署知情同意书。入选华北理工大学附属唐山市工人医院及华北理工大学附属唐山市人民医院于2008年4月至2012年12月收集的病理诊断为CRC的外周血标本，其中结肠癌病人380例，直肠癌病人450例，排除有其他恶性肿瘤病史的人群；入选同一时期在该院进行体检的健康人群作为对照组，按年龄和性别分别与病例组进行成组设计，随机选取380例健康人外周血作为结肠癌对照组，随机选取450例健康人外周血作为直肠癌对照组，排除既往肿瘤史或与病例组有血缘关系的人群。

1.2 DAF基因位点选择 通过Ensembl数据库筛选DAF基因多态性位点，筛选条件：在亚洲人群次要等位基因频率(minor allele frequency，MAF)>0.05，最终确定rs150046210，遗传变异点插入21个碱基，命名为Ⅱ基因型，缺失21碱基命名为DD基因型。

1.3 研究方法 EDTA抗凝管收集每个志愿者清晨空腹静脉血5 mL。使用天根生化科技(北京)有限公司生产的血液基因组DNA提取试剂盒(DP318)提取外周血DNA，严格按试剂盒说明书操作并将提取产物置于-20 ℃冰箱储存。采用primer 5.0软件设计DAF rs150046210 PCR引物，正向引物序列：5′-TCGTAAATAAGGAGAACCCG-3′，反向引物序列：5′-TACTGGGAGGTCTGTCAAAG-3′。PCR反应体系包括2×Ftax PCR Mix混合液3μL，基因组DNA约1～20 ng，10μmol/μL的上下游引物各0.1μL，后补足去离子水至6μL。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃延伸3 min。使用3.5%琼脂糖凝胶电泳检测，DD基因型为一个196 bp的片段，DI基因型为196 bp和217 bp的两个片段，Ⅱ基因型为一个217 bp的片段。每次PCR实验均设置空白对照孔以避免实验出现假阳性结果。为保证本研究基因分型的可靠性，随机抽取10% DNA标本进行重复实验，且重复结果与原结果一致。

1.4 统计学分析 将资料整理后用Excel录入数据，应用SPSS 23.0软件进行数据分析。使用χ2检验比较病例组与对照组基本信息(性别、年龄、吸烟和饮酒状况)及基因型的分布是否有差异。应用非条件Logistic回归分析经性别、年龄、吸烟和饮酒状况调整后的OR及95%CI，分析比较不同基因型与CRC易感性之间的关系。所有的统计检验均为双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象人口特征情况 本研究纳入结肠癌男205例(53.9%)，女175例(46.1%)，其对照组男220例(57.9%)，女160例(42.1%)。直肠癌病例男298例(66.2%)，女152例(33.8%)，其对照组男308例(68.4%)，女142例(31.6%)。结肠癌组、直肠癌组病例分别与对照组比较，性别、年龄、吸烟和饮酒状态差异均无统计学意义(P>0.05)，表示病例组与对照组间具有良好的可比性。见表1。

表1 研究对象基本特征(n，%)

2.2 DAF rs150046210多态性与CRC发病风险的关系 在结肠癌和直肠癌的对照组中，基因型的分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(HWE)，研究对象具有良好的代表性。非条件Logistic回归分析显示，与DAF rs150046210 DD基因型携带者相比，Ⅱ基因型携带者结、直肠癌发病风险均明显升高(OR=1.764，95%CI：1.763～2.675，P=0.008；OR=1.789，95%CI：1.227～2.608，P=0.003)。见表2。

表2 DAF rs150046210多态性与CRC发病风险的关系

2.3 DAF rs150046210遗传变异与CRC发病风险分层分析 为了进一步分析DAF rs150046210遗传变异与CRC发病风险的关系，对与CRC相关的多种因素(性别、年龄、吸烟和饮酒)进行分层分析。性别分层分析显示，女性中Ⅱ基因型携带者结肠癌的发病风险增加(OR=2.015，95%CI:1.085～3.742)；男性中Ⅱ基因型携带者直肠癌的发病风险增加(OR=2.041，95%CI:1.290～3.228)。年龄分层分析显示，低年龄组Ⅱ基因型携带者结肠癌的发病风险增加(OR=2.355，95%CI:1.273～4.356)；高年龄组Ⅱ、DI基因型携带者直肠癌的发病风险增加(OR=2.313，95%CI:1.334～4.012；OR=1.757，95%CI:1.106～2.789)。吸烟分层分析显示，Ⅱ基因型可以增加不吸烟病人结肠癌、直肠癌的发病风险(OR=1.791，95%CI:1.106～2.900；OR=2.395，95%CI:1.514～3.788)。饮酒分层分析显示，Ⅱ基因型增加不饮酒病人结肠癌、直肠癌的发病风险(OR=1.714，95%CI：1.086～2.704；OR=1.923，95%CI:1.221-3.030)，见表3，4。

表3 DAF rs150046210多态性与结肠癌发病风险分层分析

表4 DAF rs150046210与直肠癌发病风险分层分析

3 讨论

DAF位于1号染色体长臂的补体调控位置[7]，作为重要的CRP，在恶性肿瘤发生发展中起着重要的作用，被认为是癌症治疗的重要分子靶标。DAF属于膜结合型补体调节蛋白，通过抑制补体攻膜复合物的形成，从而使肿瘤细胞逃脱补体攻击。有研究认为,过表达DAF是CRC预后不良标志之一[8]。恶性肿瘤相关基因遗传多态性是影响人群肿瘤易感性的重要因素之一，探讨CRC相关基因与其遗传特征的关系对降低肿瘤的发生率和死亡率具有非常重要的意义。

之前有研究表明，DAF基因编码区遗传变异可增加个体罹患胃癌[9]和非小细胞肺癌[10]的风险。但是关于DAF非编码区的遗传变异是否影响老年人患CRC的发生风险还鲜有报道。本研究首次发现DAF rs150046210显著增加了老年个体罹患CRC的发病风险。

吸烟和饮酒是CRC发病的危险因素，但本研究以吸烟、饮酒状况对CRC组和对照组进行分层分析后发现，DAF基因rs150046210变异只增加不吸烟、不饮酒病人CRC的发病风险，并未发现吸烟、饮酒与携带Ⅱ等位基因对CRC发病风险有交互作用。这可能是因为吸烟、饮酒作为CRC的危险因素所产生的主效应掩盖了DAF基因多态性在CRC发病过程中所起的作用，所以只有在不吸烟、不饮酒人群中才能观察到DAF基因多态位点对CRC的影响；也可能是因为进行分层分析后的吸烟、饮酒组样本量较小导致结果的偶然性。因此，对于DAF基因非编码区基因多态性仅影响不吸烟、不饮酒者CRC发病风险的确切机制还有待进一步探索。

本研究以60岁为标准对CRC组和对照组进行年龄分层分析。结果发现，相对于DAF rs150046210 ID/DD基因型携带者，在年龄≤60岁亚组及女性亚组中，Ⅱ基因型携带者罹患结肠癌的风险分别增加了1.355倍和1.015倍；相对于DAF rs150046210 ID/DD基因型携带者，在年龄>60岁亚组及男性亚组中，Ⅱ基因型携带者罹患直肠癌的风险分别增加了1.313倍和0.257倍。表明DAF rs150046210变异使低年龄组和女性罹患结肠癌发病风险增高，也会增加高年龄组男性患直肠癌的发病风险。所以，DAF rs150046210变异对CRC易感性有影响，此外，环境等其他因素长期的协同作用也可能会增加患病风险。

综上所述，本研究结果表明DAF rs150046210变异影响老年人患CRC的遗传易感性，进一步为探索补体系统在恶性肿瘤中的作用提供了理论依据。