阿尔茨海默病中高表达的miR-182-5p靶向抑制了Neuritin的表达

孙嘉伟，宋银，宋丹丹，张雪，黄娟，章云衡，黄瑾*

(1 石河子大学医学院，新疆 石河子 832000；2 杭州师范大学医学部，浙江 杭州 310036)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种慢性神经系统退行性疾病，随人口老龄化进程的加剧，全球累计痴呆症患者已超过4700万人，这一数字将于2050年激增至1.31亿人[1]。AD主要病理特征为是脑组织中淀粉样蛋白β(Amyloid-β，Aβ)斑块沉积、神经纤维缠结、突触丢失和神经变性，从而导致患者记忆力衰退和进行性认知功能障碍[2-4]。根据阿尔兹海默病协会公布的《2020年阿尔兹海默病数据》，AD的发病率以及其所增加的社会、经济成本已远超预期，给全球经济和卫生保健系统带来了沉重的负担，寻找有效的预防、诊断、缓解和治疗药物迫在眉睫[5-6]。

Neuritin(Candidate Plasticity-related Gene 15，CPG15)，是一种与神经发育和突触可塑性密切相关的神经营养因子，在中枢神经系统发育中，Neuritin能促进神经突起的生长、神经突触的发育和维持神经元的存活[7-9]。在神经系统发育成熟后，Neuritin在可塑性相关的区域高表达，与学习记忆密切相关[10]；在神经损伤中，Neuritin重组蛋白能够促进神经纤维的再生，对神经纤维结构的重塑，神经功能的恢复有改善作用[11-13]。最近的研究发现Neuritin在AD模型小鼠海马区的表达降低，过表达Neuritin能降低神经纤维缠结密度[14]，改善神经元状态[15]，给予Neuritin蛋白能显著提高其海马神经元树突棘密度[16]，在一定程度上减轻认知功能损伤[17]。然而，Neuritin在AD中表达下调的机制尚不明确。

MicroRNA(miRNA)是一类长度为20-23个核苷酸的小的非编码RNA分子，通过转录后的调控作用，影响靶基因的表达。特定miRNA的表达失调可能与多种疾病的发生发展相关[18-20]。我们发现部分miRNA也参与了Neuritin的表达调控[21-22]，因此，我们推测AD中某些特异miRNA可能参与了Neuritin的表达调控，进而影响AD的发生和发展。

本研究通过生物信息学分析和靶基因预测[23-25]，筛选出可能在AD中靶向调控Neuritin的目标miRNA，并利用AD模型小鼠明确目标miRNA与Neuritin的相关性，进一步在细胞水平探讨在AD中高表达的目标miRNA对Neuritin的靶向调控作用。

1 材料与方法

1.1 生物信息学分析

在NCBI网站GEO DataSets数据库中(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)，以阿尔茨海默病和microRNA为指标进行检索，排除表观遗传学的影响，获得在AD模型小鼠脑组织中差异表达的miRNA数据集(GSE46579，GSE138382)，使用R语言软件对差异表达的miRNA进一步筛选，获得的AD模型小鼠中高表达的候选miRNA。分别利用4个不同的靶基因预测网站(TargetScan，Starbase，miRBD，DIANA)，检索分析靶向Neuritin的miRNA。将数据库中获得的AD模型小鼠中高表达的候选miRNA，与靶向Neuritin的miRNA二者取交集，获得在AD中表达上调并可能靶向调控Neuritin的目标miRNA，P<0.05,以|log2FC |≥1为阈值进行筛选。使用T-Coffee软件(https://www.ebi.ac.uk/Tools/services)对目标miRNA进行双序列全局比对。

1.2 动物饲养及鉴定

AD模型小鼠为APP/PS1基因修饰小鼠，背景品系为B6C3F1小鼠(WT小鼠)，均购自于南京大学南京生物医药研究院，繁殖并饲养于杭州师范大学实验动物中心SPF级实验室。繁育的小鼠均被剪取脚趾进行基因型鉴定。提取小鼠DNA后(DNA提取试剂盒，TIANGEN，DP304-03)，针对APP/PS1基因修饰小鼠的特异基因APP、Psen1及β-actin设计三对引物，引物序列见表1。通过PCR扩增鉴定小鼠的基因型。PCR反应体系如下：25 μL；95 ℃，5 min；95 ℃，30 s；65 ℃，30 s，72 ℃，40 s；72 ℃，5 min；35个循环，4 ℃储存。

1.3 实时定量荧光PCR (qRT-PCR)

将鉴定后的雌性AD小鼠和WT小鼠使用qRT-PCR检测候选miRNA的表达水平。使用柱式microRNA抽提试剂盒(Sangon，B518811)提取两组小鼠海马区和皮质组织的总RNA，通过第一链cDNA合成试剂盒(Thermo Scientific，EP0733)逆转录合成cDNA(反应体系：14.5 μL；25 ℃，10 min；50 ℃，30 min；85 ℃，5 min；72 ℃，1 min；4 ℃储存)。使用qRT-PCR试剂盒(Takara，RR082 A)检测候选miRNA(miR-182-5p)的表达水平(反应体系：10 μL；95 ℃，3 min；95 ℃，15 s；57 ℃，20 s；72 ℃，30 s；45个循环)，以U6 RNA的表达水平作为参照。

1.4 细胞培养

人胚胎肾细胞(293T细胞)，购自于中国科学院细胞库，使用含10%胎牛血清的DMEM培养基，培养在37 ℃的CO2培养箱中。将对数期生长的293T细胞平均接种到6孔板中，约为1×106个细胞/孔，3孔/组，用于后续实验。

1.5 miR-182-5p模拟物的合成与转染

将Sangon Biotech公司合成的人源miR-182-5p模拟物(mimics)和阴性对照模拟物(NC mimics)，通过Lipofectamine 3000(Thermo Scientific，MAN0009872)分别转染至293T细胞(20 μM)，37 ℃培养12 h。

1.6 免疫印迹分析(Western Blot，WB)

提取来源于组织或细胞的总蛋白，用BCA蛋白检测试剂盒(碧云天，P0012)测定提取蛋白的浓度，12.5%SDS-PAGE电泳后，23 V，43 min转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，使用 Neuritin抗体(Abcam，ab64186，1∶1 000)4 ℃孵育过夜；山羊抗兔二抗IgG-HRP抗体(ZSGB-BIO,ZB-2301，1∶2 500)室温孵育2 h，曝光。以β-actin(ZSGB-BIO，TA-09，1∶1000)作为内对照。

1.7 荧光素酶报告基因实验

将293T细胞接种于24孔培养板中12 h，分为3组，通过Lipofectamine 3000(Thermo Scientific，MAN0009872)分别将pLUC-NC、pLUC-Neuritin、pLUC-MUT-Neuritin(吉玛基因)与miR-182-5p mimics共转染(20 μmol·L-1)，12 h后，用双荧光素酶报告系统(Promega，E1330)分析荧光素酶活性。

1.8 统计学分析

所有实验计量数据都以平均值±标准差表示，运用Photoshop软件进行Western Blot图像结果灰度值，运用GraphPad Prism 8软件进行统计学分析与绘图，用*P<0.05，**P<0.01，表示差异有统计学意义。

表1 引物名称及序列

2 结果

2.1 从AD模型小鼠miRNA数据集中筛选分析AD中差异表达的miRNA(图1)

我们在NCBI网站的GEO DataSets数据库中检索了AD模型小鼠和 microRNA的相关数据集，在排除表观遗传学的影响下，获得了在AD模型小鼠脑组织中差异表达的miRNA数据集。

研究组新生儿呼吸机相关肺炎5例（7.14%），住院时间为（16.67±1.31）d；对照组新生儿呼吸机相关肺炎14例（20.00%），住院时间为（21.26±1.07）d，两组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

A、B：AD模型小鼠miRNA数据集(GSE46579-A，GSE138382-B)中差异表达miRNA的火山图，红色表示表达上调，蓝色表示表达下调， 灰色表示没有统计学差异；C：数据集GSE46579(蓝色)和GSE138382(黄色)中共同表达上调miRNA的韦恩图。图1 AD中差异表达miRNA的筛选分析

我们对GEO DataSets数据库获得的2个AD模型小鼠脑组织miRNA数据集(GSE46579，GSE138382)进行了生物信息学分析，火山图显示了2个数据集中差异表达的miRNA(图1)，红色表示表达上调，蓝色表示表达下调。按照P<0.05，|log2FC|≥1的筛选标准，GSE46579数据集中有68个(图1 A)miRNA表达上调，GSE138382数据集中有185个miRNA表达上调(图1B)，二者取交集，共有4个miRNA在这2个数据集中呈现共表达上调(图1C)。

2.2 生物信息学预测靶向调控Neuritin的候选miRNA

为获得调控Neuritin表达的候选miRNA，我们利用4个不同的靶基因预测网站检索分析了靶向Neuritin的miRNA，其中有20个miRNA在4个预测网站中均显示可能靶向调控Neuritin的表达(图2)。

图2 靶向调控Neuritin的候选miRNA预测

2.3 目标miRNA的筛选及确定

为进一步确定在AD中靶向调节Neuritin的目标miRNA，我们对来自AD数据集中的候选miRNA和靶向Neuritin的miRNA进行了交集分析，如图3所示，筛选出1个重叠的miRNA—miR-182-5p，即AD中高表达、且可能靶向调控Neuritin的miRNA。因此，我们确定miR-182-5p作为目标miRNA进行进一步研究。

图3 AD中靶向Neuritin的目标miRNA

2.4 AD模型小鼠的选择及基因型鉴定

根据APP/PS1基因修饰小鼠的特异序列APP和Psen1基因，PCR扩增鉴定小鼠的DNA。鉴定结果如图4所示，同时出现APPswe、PSEN1dE9和β-actin 3条特异性条带的小鼠为AD模型小鼠，仅出现β-actin条带的小鼠为WT小鼠。

APPswe条带约为 250 bp、PSEN1dE9条带约为 608 bp、β-actin条带约为 324 bp，其中4、5、9、10、15、 17、18、21、25、26、29、31号鼠为APP/PS1阳性鼠，其余编号鼠为APP/PS1阴性鼠。图4 APP/PS1基因修饰小鼠基因组PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳结果

2.5 AD模型小鼠海马及皮质组织中miR-182-5p的表达

为明确目标miRNA在AD模型小鼠脑组织中的表达，我们分别提取了AD和WT小鼠大脑海马区和皮质组织的RNA，逆转录合成cDNA，通过qRT-PCR检测miR-182-5p的表达情况。

结果如图5所示，AD小鼠海马组织中miR-182-5p的表达水平显著高于WT小鼠(图5 A，P<0.05)，而miR-182-5p在两组小鼠大脑皮质中的表达没有统计学差异(图5B，P>0.05)。

A、B：miR-182-5p在AD模型小鼠海马(A)和皮质(B)中的qRT-PCR结果;*P<0.05 vs WT组。图5 AD模型小鼠脑组织中miR-182-5p的表达

2.6 AD模型小鼠海马及皮质组织中Neuritin的表达

为明确Neuritin蛋白在AD模型小鼠脑组织中的表达，我们分别提取了AD和WT小鼠脑组织的蛋白质，通过WB检测Neuritin蛋白在海马区和皮质组织中的表达情况。与WT小鼠相比，AD小鼠海马组织中Neuritin蛋白的表达降低(图6A)，有显著的统计学差异P<0.01(图6B)；而在皮质组织中两组小鼠Neuritin蛋白的表达没有统计学差异P>0.05(图6C)。

A-C：AD模型小鼠海马和皮质中Neuritin蛋白表达的WB结果(A)及量化，海马(B)，皮质(C)；**P<0.01 vs WT组。图6 Neuritin蛋白在AD模型小鼠脑组织中的表达

2.7 miR-182-5p对Neuritin蛋白的抑制作用

A：hsa-miR-182-5p和mmu-miR-182-5p的双序列全局比对;B-C:miR-182-5p mimics组和NC mimics组中 Neuritin表达的WB结果(B)及量化图(C)；*P<0.05 vs NC组。图7 miR-182-5p对Neuritin蛋白的抑制作用

2.8 miR-182-5p对Neuritin的靶向调控作用

为了明确miR-182-5p对Neuritin表达调控的特异性(靶向性)，我们根据miR-182-5p与Neuritin 3′UTR区结合的特异位点(图8A)，分别设计并构建了含有neuritin 3′-UTR的 NC和MUT-neuritin的荧光素酶报告基因系统，结果显示，与pLUC-NC组相比，pLUC-neuritin组的荧光素酶活性降低(图8B，P<0.001)，说明miR-182-5p通过作用于Neuritin 3′UTR区，抑制了荧光素酶报告基因的活性；而pLUC-MUT-neuritin组的荧光素酶活性较pLUC-neuritin组的荧光素酶活性有所升高(图8B，P<0.01)，说明这些突变位点为miR-182-5p作用于Neuritin 3′UTR所特异的。

A：miR-182-5p靶向的Neuritin 3′UTR区位点示意图； B：pLUC-neuritin和pLUC-MUT-neuritin的萤光素酶活性。 **P<0.01，***P<0.001 vs NC组。图8 miR-182-5p对Neuritin的靶向调控作用

3 讨论

AD是一种神经退行性疾病，严重危害人类健康，目前尚缺乏有效的治疗手段[27]。研究发现在AD中Neuritin的表达降低，且给予Neuritin蛋白能改善AD症状[17]。然而，Neuritin表达降低的原因尚不清楚。本研究揭示了AD模型小鼠中miR-182-5p表达升高，且可以靶向抑制Neuritin的表达。

首先，为获得在AD中差异表达的miRNA，我们通过生物信息学手段从GEO DataSets数据库中检索了AD相关性的miRNA数据集和文献，在排除表观遗传学影响的条件下，筛选出2个来源于AD模型小鼠脑组织样本的相关数据集(GSE46579，GSE138382)。运用R语言分析软件富集了数据集中表达上调的miRNA，筛选出4个可能参与AD调控的候选miRNA。与此同时，我们通过4个靶基因预测网站分析预测出237个可以靶向Neuritin 3′-UTR区的miRNA，其中选取了20个出现频率显著增高的miRNA(图2)作为可能靶向调控Neuritin的候选miRNA。为了确定在AD中靶向调节Neuritin的目标miRNA，我们对可能参与AD调控的候选miRNA和可能靶向调控Neuritin表达的候选miRNA进行了交集分析(图3)，获得了1个重叠的miRNA，即miR-182-5p，作为我们进一步研究在AD发生发展过程中靶向调节Neuritin的目标miRNA。

为进一步明确AD中目标miRNA的表达与Neuritin表达的相关性，根据数据集中miR-182-5p的种属来源，我们选择了AD模型小鼠进行进一步的验证。APP/PS1 基因修饰小鼠因其可同时表达突变的人鼠淀粉样前蛋白(APPswe)和人类早老素(PSEN1dE9)基因而成为研究AD发病机制的理想小鼠模型[28-29]。我们首先对该基因修饰的AD模型小鼠进行了基因型鉴定(图4)，然后分别检测了miR-182-5p和Neuritin的表达，qRT-PCR检测结果显示(图5)，相较于WT小鼠，AD小鼠海马区miR-182-5p的表达显著增高(P<0.05)；WB检测结果显示(图6)，AD小鼠海马区Neuritin的表达显著低于WT小鼠(P<0.01)，说明AD模型小鼠中miR-182-5p的表达与Neuritin的表达呈负相关，提示Neuritin的表达降低可能是由于miR-182-5p的表达异常(增高)所致。

为探讨miR-182-5p对Neuritin表达的调控作用，我们首先分析了人源性和小鼠源性miR-182-5p的序列，发现两者高度同源(图7A)。进而合成了人源性miR-182-5p mimics并转染至293T细胞，结果显示(图7)，与NC 对照组相比，miR-182-5p mimics处理组的Neuritin蛋白表达水平明显降低(P<0.05)，说明miR-182-5p抑制了Neuritin的表达。而荧光素酶报告基因的实验结果(图8)则进一步说明：miR-182-5p可以通过与Neuritin 3′UTR区的特异性结合，靶向抑制了Neuritin的表达。

miR-182-5p被证明是体内重要的调节因子，在多种组织发挥作用[30]。在神经系统中，参与了神经元存活[31]、轴突发生[32]和蛋白信号转导[33]等多种生物学过程。无独有偶，与Neuritin在神经系统活动中发挥作用的时间和空间相一致[7-9]。尽管研究发现，在神经胶质瘤细胞中，miR-182可靶向下调Neuritin的表达[34]，但AD中miR-182-5p对Neuritin蛋白的靶向作用未见文献报道。

本研究综合利用生物信息学手段、动物实验和分子细胞生物学技术，揭示了AD中miR-182-5p与Neuritin表达的相关性，明确了miR-182-5p通过靶向抑制Neuritin表达，参与了AD的发生发展过程，为AD的诊断和治疗提供了一个新的分子靶标，对于AD分子生物学研究具有重要的意义。