泛素连接酶E4B 介导POLDIP2的泛素化及其降解

李莎莎，赵博

(上海交通大学药学院，上海 200240)

泛素(Ubiquitin，Ub)是含有76个氨基酸残基的蛋白质，可以通过E1-E2-E3级联反应传递至底物蛋白，介导蛋白质的泛素化[1-2]。其中，泛素活化酶E1通过水解ATP使其半胱氨酸残基和泛素C末端形成高能硫酯键，接着将活化的Ub以硫酯键结合的方式传递至泛素结合酶E2上，最后在泛素连接酶E3的作用下，Ub以共价结合的方式传递至底物蛋白的赖氨酸上,使得底物蛋白泛素化[3-4]。在真核细胞中，泛素化(ubiquitination)是一种重要的蛋白质翻译后修饰，它可以通过26S蛋白酶体介导底物蛋白的降解，或者调节底物蛋白的生物学功能[3,5]。

UBE4B(简称E4B)是U-box家族泛素连接酶的一员，其基因位于人类染色体1p36上[6]，是酵母细胞中E4酶UFD2的哺乳动物同源物，因此E4B也具有E4的功能[7]。在人类细胞中，E3s的数量超过600个，且E3s决定了底物蛋白识别的特异性，然而600多种E3s和底物蛋白之间错综复杂的关系使得鉴定特定E3s的底物变得尤为困难。实验室前期开发了正交泛素传递(orthogonal ubiquitin transfer,OUT)的方法来探索E3s底物特异性。在OUT途径中，突变的Ub(xUb)在HEK293细胞内可以通过突变的E1，E2和E3(xE1，xE2，xE3)转移至特定E3的底物上，将细胞裂解后通过Ni-NTA和链霉亲和素树脂串联亲和层析纯化xUb偶联的蛋白，富集的蛋白质经胰酶消化得到一系列的肽段，通过高效液相色谱-串联质谱联用(LC-MS/MS)的方法对肽段进行检测分析即可得到E4B的潜在底物蛋白[8]。通过该方法，我们检测到聚合酶δ相互作用蛋白2(Polymerase δ-interacting protein 2，POLDIP2)可能是泛素连接酶E4B的潜在底物，但仍需通过其他方法进一步验证E4B是否能够介导POLDIP2的泛素化。

为了鉴定POLDIP2是否是真核细胞中E4B的底物，本研究设立了体外蛋白泛素化反应，并在HEK293细胞、E4B敲减稳转株(shE4B)、E4B过表达细胞株(E4B OE)中检测E4B表达量的变化是否影响POLDIP2的泛素化水平。其次，我们进一步探究E4B泛素化POLDIP2能否介导其通过26S蛋白酶体进行降解，以期进一步阐明泛素化降解对于POLDIP2在真核细胞中行使功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人胚肾细胞(HEK293)购自中国科学院细胞库；胎牛血清、DEME高糖培养基、Opti-MEM基础培养基均购自Gibco公司；Anti-UBE4B抗体(ab126759)、Anti-HA抗体(ab182009)购自abcam公司；Anti-GAPDH 抗体(60004-1-Ig)购自proteintech公司；Anti-FLAG(M2))抗体(F1804)购自美国sigma-Aldrich公司；山羊抗兔荧光二抗(111-655-144)及山羊抗鼠荧光二抗(115-005-072)购自Jackson ImmunoResearch公司；Anti-FALG(M2)affinity gel (A2220) 购自Sigma-Aldrich公司；胶回收试剂盒、小提质粒试剂盒均购自Omega公司；限制性核酸内切酶、T4 DNA ligase均购自NEB公司；感受态细胞由实验室制作并保存；蛋白酶体抑制剂MG132(HY-13259)、蛋白酶抑制剂混合物PIC均购自MCE公司;N-ethymaleimide(NEM)购自 Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒的构建

1.2.1.1 PCR扩增获取目的基因

根据NCBI中POLDIP2的全长基因序列，按照引物设计原则设计上下游引物，为与载体连接，分别在上下游引物中引入BamHⅠ和NotⅠ 酶切位点，引物设计如下(表1)。以cDNA为模板，进行PCR扩增，反应体系如下：1 μL cDNA模板、上下游引物各1 μL、1 μL KOD-Plus- Neo、5 μL 10×PCR Buffer for KOD-Plus- Neo、5 μL 2 mmol·L-1dNTPS、3 μL 25 mmol·L-1MgSO4、加入ddH2O补至50 μL。将各组分轻轻混合，经预变性94 ℃ 2min，变性98 ℃ 10 s，复性(Tm-5) ℃ 30 s,引物延伸68 ℃ 30 s/kb，35个循环之后，便得到目的基因片段。该基因片段经过琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒进行回收。

表1 目的基因引物序列

1.2.1.2 His-pET28a、Flag-pcDNA3.1载体酶切及酶连

使用BamH Ⅰ和NotⅠ对His-pET28a、Flag-pcDNA3.1载体及上述PCR基因片段进行酶切，体系如下：1μg基因、5 μL 10×NEBuffer、1 μLBamHⅠ、1 μLNotⅠ、ddH2O补齐至50 μL，于37 ℃酶切2～3 h。酶切后的载体经琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收，而酶切之后的目的基因片段直接使用胶回收试剂盒进行回收。分别得到载体和目的基因的酶切产物，接着使用T4 DNA ligase进行酶连。酶连体系如下：载体和基因片段按照摩尔比1∶7加入相应量的体积、1 μL T4 DNA Ligase Buffer (10×)、0.5 μL T4 DNA ligase，加入ddH20补齐至10 μL，于室温反应1 h，即得到酶连产物：pET28a-Flag-POLDIP2、pcDNA-Flag-POLDIP2。取5 μL酶连产物经过化学转化的方法，将重组质粒与50 μL DH5α感受态细胞混合均匀，冰上孵育30 min，42 ℃热击90 s，冰敷2 min，加入1 mL培养基混合，于37 ℃摇床复苏1 h，接着将感受态细胞均匀涂在相应抗性的细菌培养板上，37 ℃过夜培养。挑取单克隆细胞，提取质粒，得到的质粒经过DNA测序确定其是否为正确的目的基因序列。

1.2.2 蛋白表达及纯化

第一天，将经过测序的正确重组质粒，通过化学转化的方法，转入BL21感受态细胞中，涂布于含有kana抗生素的细菌培养板上，过夜培养。第二天，挑取单克隆细胞于5 mL LB中，37 ℃，220 r·min-1培养过夜。第三天，将上述细菌培养液接种于1 L相应抗性的LB中，于37 ℃，220 r·min-1培养至细菌的OD600=0.6～0.8，接着加入1 mL 1 M IPTG至终浓度为1 mmol·L-1,于16 ℃诱导表达10～16 h。第四天，将上述完成蛋白表达的菌液于4 ℃，7 000 r·min-1离心10 min收集细胞，弃上清。加入10 mL Lysis Buffer (50 mmol·L-1Tris Base,500 mmol·L-1NaCl,5 mmol·L-1Imidazole,pH 8.0) 将细胞重悬，高压破碎细胞。将细胞裂解液于4 ℃，12 000 r·min-1离心30 min 收集上清，并加入500 μL提前处理好的镍性填料，于4 ℃转盘结合2 h。

将上述混合物加入提前处理好的重力柱中，流出的裂解液即为流穿液，需保留。依此用15 mL Lysis Buffer 洗一次，15 mL Wash Buffer (50 mmol·L-1Tris Base,500 mmol·L-1NaCl,100 mmol·L-1Imidazole,pH 8.0)洗两次，以上洗脱液均需要保留。接着用3～5 mL Elution Buffer (50 mmol·L-1Tris Base,500 mmol·L-1NaCl,250 mmol·L-1Imidazole,pH 8.0) 洗脱蛋白。将上述得到的BL21裂解液、裂解液离心后的上清、流穿液和最终洗脱液经SDS-PAGE电泳分离，考马斯亮蓝染色，将含有目的蛋白条带的洗脱液进行下一步操作。加入合适大小的透析袋中，于1 L 透析液(25 mmol·L-1Tris Base,150 mmol·L-1NaCl,0.5 mmol·L-1DTT,pH 8.0)4 ℃摇床透析4 h,接着更换1 L新的透析液，4 ℃摇床透析过夜。第5天，取出透析袋，在透析袋外部撒适量的PEG-20 000，浓缩蛋白溶液。接着吸出蛋白质溶液，分装于EP管中，取少量测浓度，其余蛋白于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 细胞培养及转染

液氮冻存的HEK293细胞经37 ℃水浴复苏，使用含有10% 胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，于37 ℃，含有5% CO2的培养箱中培养。定期观察细胞状态，及时换液和传代，一般情况3 d传代1次。一般传代3次之后，细胞状态趋向稳定，此时使用胰酶消化细胞并计数，取2.3×106个细胞铺于6 cm 细胞培养皿中，使其细胞汇合度为70%～80%，第二天进行细胞转染。转染前1 h，将细胞培养基换成Opti-MEM基础培养基。用一定体积Opti-MEM稀释质粒，轻轻吹打混匀，标记为A液；用相应体积的Opti-MEM稀释转染试剂PEI，轻轻吹打混匀，标记为B液，一般情况下，质粒与PEI的体积之比为1∶3。A液和B液在室温静置5 min，然后将B液滴入A液中，轻轻吹打混匀，室温放置20 min以形成转染复合物。将转染复合物轻轻均匀滴入细胞中，并轻轻晃动细胞培养皿，置于培养箱中培养16～18 h，然后将Opti-MEM培养基换为DMEM培养基。继续培养细胞，一般情况下，细胞转染48 h 时用合适的细胞裂解液裂解细胞。

1.2.4 免疫共沉淀

细胞转染48 h后用含有蛋白酶抑制剂PIC及PMSF(对于细胞内泛素化鉴定，则需另外加入去泛素化酶抑制 NEM(100 μmol·L-1)和O-Phenanthroline(100 μmol·L-1)的RIPA细胞裂解液(50 mmol·L-1Tris,150 mmol·L-1NaCl 1% NP-40,0.1% SDS,EDTA，pH 7.4)将细胞裂解，弃细胞培养基，加入2 mL预冷PBS轻轻洗两遍细胞，接着加入适量RIPA裂解液，冰上放置10 min，用细胞刮刀刮下细胞置于EP管中。将细胞裂解液置于冰上，于摇床摇晃EP管进一步裂解30 min，然后于4 ℃，13 000 r·min-1离心15 min，上清转移至新的EP管中。使用BCA试剂盒测蛋白浓度，取1 mg 总蛋白用于免疫共沉淀。免疫共沉淀分为3个步骤：(1)beads预处理:每个样品取15 μL Anti-Flag (M2) affinity gel 的50% 混悬液，7 000 g离心1 min，弃上清。加入1 mL预冷的TBS，轻轻摇晃EP管，于4 ℃，7 000 g,离心1 min，接着重复清洗两次；(2)孵育：取1 mg 总蛋白于EP管中，加入将上述清洗过的Anti-Flag (M2) affinity gel，于4 ℃ 转盘结合4 h；(3)清洗beads:取出EP管，于4 ℃，7 000 g，离心1 min,将上清转移至新的EP管中，-40 ℃保存。Beads 中加入1 mL 预冷的TBS-T，轻轻摇晃EP管，于4 ℃，7 000 g,离心1 min，接着重复清洗四次。最后一次弃全部上清，加入30 μL TBS,9 μL 5×SDS 上样缓冲液，Vortex 10 s,然后7 000 g，离心1 min。样品经99 ℃煮样15 min，7 000 g，离心1 min，取适量上清进行western blot，剩余上清于-40 ℃保存。

1.2.5 POLDIP2与E4B相互作用

为检测POLDIP2与E4B在HEK293细胞中是否存在相互作用，将HEK293细胞铺至6 cm皿，共转染2 μg pcDNA-Flag-POLDIP2质粒与2 μg pLVX-E4B质粒，只转染2 μg pLVX-E4B质粒的细胞为阴性对照。转染后48 h使用RIPA将细胞裂解，分别取1 mg总蛋白进行免疫共沉淀，使用anti-Flag (M2) affinity gel 拉下Flag-POLDIP2,在western blot 中使用anti-E4B抗体检测E4B是否与POLDIP2存在相互作用。

1.2.6 胞外泛素化反应

为验证POLDIP2是泛素连接酶E4B的的底物，设置了体外泛素化反应。反应体系如下：10 μmol·L-1Flag-POLDIP2、14 μmol·L-1Ub、1 μmol·L-1E1(Uba1),5 μmol·L-1E2(UbcH5b),1 μmol·L-1E3(E4B)、50 mmol·L-1MgCl2和1.5 mmol·L-1ATP，加入TBS补齐至50 μL，于室温反应2 h，加入12.5 μL 5×SDS上样缓冲液，99 ℃煮样10 min。同时设置五组阴性对照：分别不含E1、E2、E3、Ub和底物蛋白。反应产物进行western blot，使用anti-Flag抗体对POLDIP2的泛素化进行检测。

1.2.7 胞内泛素化鉴定

为在HEK293细胞内鉴定POLDIP2是否为E4B的底物，E4B敲减稳转株(shE4B)、HEK293、E4B过表达(E4B OE)3种细胞株分别瞬时转染pcDNA-Flag-POLDIP2质粒及pcDNA-HA-Ub质粒，转染后48 h裂解细胞，收样前4 h 用终浓度为10 μM 的MG132处理细胞。取1 mg 总蛋白进行免疫共沉淀，使用anti-Flag (M2) affinity gel 拉下Flag-POLDIP2，在western blot 中使用anti-Ub抗体对POLDIP2的泛素化进行检测。

1.2.8 E4B介导POLDIP2的泛素化降解

为检测HEK293细胞内E4B对于POLDIP2蛋白稳定性的影响，在HEK293细胞中瞬时转染pcDNA-Flag-POLDIP2质粒，同时转染依次增量的pLVX-E4B质粒，转染48 h收样。另一方面，也可以利用CHX Chase 实验检测E4B对于POLDIP2的降解作用。将1×106个HEK293细胞铺板于六孔板，分别共转染1.5 μg pcDNA-Flag-POLDIP2质粒和1 μg pLVX-E4B质粒或1.5 μg pcDNA-Flag-POLDIP2质粒和1 μg pLVX空质粒，转染后48 h收样。每组设立五个对照，分别在收样前0、2、4、6、8 h加入CHX (终浓度50 μg·mL-1)。在western blot 中使用anti-E4B及anti-Flag抗体检测细胞裂解液中E4B及POLDIP2的水平，以鉴定E4B能否影响POLDIP2蛋白质的稳定性。

2 结果

2.1 POLDIP2目的基因获取及重组质粒构建

以人胚肾细胞HEK293提取的总RNA为模板，逆转录获得cDNA。接下来，以该cDNA为模板，通过PCR获取POLDIP2目的基因，经琼脂糖凝胶电泳分离，发现目的基因条带大小正确(图1A)。目的基因和pET28a载体及pcDNA载体分别经BamHⅠ 和NotⅠ 双酶切并通过琼脂糖凝胶电泳分离鉴定(图1B、1C)，通过T4连接酶进行酶连，得到的重组质粒经过琼脂糖凝胶电泳分离验证，发现重组质粒大小明显大于空载,且测序结果显示构建成功。

A：以cDNA为模板，通过PCR获取POLDIP2基因；B：泳道3为正常His-Flag-pET28a载体，泳道4为双酶切后的pET28a载体; C：泳道5为正常Flag-pcDNA，泳道6为双酶切后的pcDNA载体。图1 POLDIP2 基因获取及重组质粒构建

2.2 POLDIP2蛋白表达纯化及体外泛素化验证

为了验证POLDIP2是否为泛素连接酶E4B的底物，首先设置了体外蛋白质泛素传递反应，即在体外分别表达POLDIP2、E1(Uba1)、E2(UbcH5b)、E3(E4B)、Ub蛋白，在ATP提供能量的情况下，观察Ub能否通过E1、E2、E3最终传递至POLDIP2上，从而初步判断POLDIP2是否为E4B底物。我们将BL21裂解液、BL21离心后的上清、镍柱吸附后的流穿液以及Elution Buffer的洗脱液经过SDS-PAGE跑胶分离，发现可以得到分子量为42KDa的较为纯净的POLDIP2蛋白(图2A)。实验室前期已有E1、E2、E3、Ub蛋白，因此设置体外泛素化反应体系，反应一共分为六组，第一组为完整的反应体系，其余组分依次缺少E1、E2、E3、Ub、POLDIP2，这样做的目的是为了形成阴性对照，避免出现假阳性的结果。由于表达的POLDIP2蛋白带有Flag标签，因此在western blot中，我们使用anti-Flag抗体来检测POLDIP2的泛素化。结果表明，相对于其他阴性对照组，第一组的POLDIP2的泛素化smear条带是最强的(图2B，泳道1)，而没有POLDIP2存在时，没有任何条带(图2B)，这就说明Ub能够通过E1、E2、E3将Ub传递至POLDIP2上，初步说明POLDIP2是E4B的底物。

A：泳道1为BL21细胞裂解液；泳道2为BL21细胞裂解液离心之后的上清，保留上清液的目的是为了判断POLDIP2是否为可可溶性蛋白； 泳道3为没有和镍柱结合的蛋白质溶液；泳道4为含100 mmol·L-1咪唑的Elution Buffer作用镍柱之后的洗脱液； B：体外蛋白质泛素化传递的结果，泳道1为完整的泛素传递体系，泳道2、3、4、5、6分别缺失E1、E2、E3、Ub、POLDIP2蛋白。图2 POLDIP2蛋白表达纯化及体外泛素化验证

2.3 POLDIP2与E4B在HEK293细胞内相互作用及胞内泛素化验证

由于原核表达系统所诱导表达的蛋白质可能缺乏合适的翻译后修饰，使得上述体外泛素化反应结果并不能充分说明E4B能够泛素化POLDIP2，因此，我们进一步在人的胚肾细胞HEK293中验证POLDIP2是否为E4B的底物。我们首先在HEK293细胞中证明E4B能否和POLDIP2相互作用，在HEK293细胞中共转染pcDNA-Flag-POLDIP2和pLVX-E4B质粒，利用免疫共沉淀拉下POLDIP2蛋白，在western blot 中能够检测到E4B蛋白泳道2(图3A)。在阴性对照组中，只转染pLVX-E4B质粒，没有转染pcDNA-Flag-POLDIP2，目的是为了检测免疫共沉淀中beads的非特异性结合，结果显示该beads的非特异性结合非常弱泳道1(图3A)，说明实验结果可信度高。

为进一步在HEK293细胞中验证E4B能够将POLDIP2泛素化，实验室前期利用shRNA敲减E4B并获得E4B敲减稳转株(shE4B),和HEK293细胞相比，shE4B细胞的裂解液中E4B水平明显下降(图3B)，同时在HEK293细胞瞬时转染pLVX-E4B质粒(E4B OE)，其细胞裂解液中E4B水平明显升高(图3B)。在shE4B、HEK293、E4B OE三组细胞中，分别瞬时转染pcDNA-Flag-POLDIP2和pcDNA-HA-Ub质粒，并利用免疫共沉淀拉下POLDIP2蛋白，以检测与其结合的Ub的量。在shE4B细胞中，POLDIP2泛素化的smear条带明显比HEK293细胞弱，说明E4B的敲减减弱了POLDIP2的泛素化(图3C，泳道1)；同样，在E4B OE细胞中，POLDIP2的泛素化smear条带液明显比HEK293细胞强(图3C，泳道3)，说明E4B的过表达增强了POLDIP2的泛素化。以上结果表明，在HEK293细胞中，E4B能够和POLDIP2相互作用，并且能够介导POLDIP2的泛素化，进一步证明POLDIP2是E4B的底物。

A：E4B+POLDIP2共转染细胞和只转染E4B细胞的裂解液中E4B，Flag-POLDIP2,GAPDH表达情况，及细胞裂解液经anti-Flag (M2) affinity gel捕获后孵育anti-E4B抗体检测E4B和POLDIP2的蛋白质-蛋白质相互作用；B：shE4B、HEK293、E4B过表达三种细胞 共转染HA-UB、Flag-POLDIP2时，细胞裂解液中各个蛋白质的表达情况；C：在(B)中的细胞裂解液经anti-Flag (M2) affinity gel捕获后孵育anti-HA抗体检测POLDIP2的泛素化修饰水平。图3 POLDIP2与E4B相互作用及细胞内泛素化检测

2.4 E4B介导POLDIP2的泛素化降解

细胞外泛素传递反应和细胞内泛素化验证均能够证实POLDIP2是泛素连接酶E4B的底物。虽然泛素化主要介导蛋白质经由26S蛋白酶体降解，但也可以调节蛋白质的功能，参与细胞内其他生命活动。因此，我们进一步检测E4B泛素化POLDIP2之后能否介导其通过26S蛋白酶体降解。首先，在HEK293细胞中不断增加pLVX-E4B的转染量，pcDNA-Flag-POLDIP2的转染量保持不变，可以观察到随着E4B表达量不断升高，POLDIP2的水平不断下降(图4A)。说明E4B对POLDIP2的泛素化可能影响其降解过程，随着E4B表达量增加，对POLDIP2的泛素化不断加强，使得POLDIP2的水平下降。除此之外，CHX Chase assay是一种经典的测定细胞内蛋白质降解速率的方法，通过放线菌酮(CHX)抑制细胞中新的蛋白质合成，我们可以探究细胞内已表达蛋白质的降解情况。通过比较HEK293细胞、E4B敲减稳转株(shE4B)、E4B过表达细胞株(E4B OE)中POLDIP2蛋白降解速率的快慢，我们就可以判断E4B是否能够促进POLDIP2的降解过程。如图，HEK293细胞中的POLDIP2随着CHX作用时间延长，水平有所降低(图4B,左图)，但在E4B过表达细胞中，POLDIP2随着CHX作用时间的延长，其水平下降的幅度更大(图4B,右图)，表明E4B过表达破坏了POLDIP2蛋白质的稳定性，加速POLDIP2的降解。综上所述，E4B可以介导POLDIP2的泛素化并促进其经由蛋白酶体降解，从而调节POLDIP2蛋白质的稳定性。

A：不同E4B转染量情况下，POLDIP2的水平变化；B：CHX Chase实验， 左图是HEK293细胞中POLDIP2的水平变化，右图是E4B过表达细胞中POLDIP2的水平变化。图4 E4B介导POLDIP2的泛素化降解

3 讨论

POLDIP2是由368个氨基酸残基组成的多功能蛋白质[9]，在结构上，POLDIP2由N末端线粒体定位序列及两个高度保守的结构域组成：ApaG/F box A结构域和半甲基化DNA结合结构域YccV[10];在定位上，其在细胞内的定位因细胞类型不同也有所差异[11]，但主要分布于线粒体中[12]。LIU Li等[9]在2003年首次发现POLDIP2蛋白，并阐明其与DNA聚合酶以及增殖细胞核抗原(PCNA)的相互作用，此后越来越多的研究证明，POLDIP2是一个多功能蛋白质，在生物体内承担十分重要的生物学功能，对细胞生命活动的正常发挥至关重要。例如，POLDIP2的YccV结构域可以和DNA聚合酶结合，参与调节DNA的复制、修复和损伤耐受；此外，POLDIP2也可以调控细胞周期[10]、参与前体mRNA的加工[13]、调节细胞核氧化微环境[14]、参与调控线粒体形态和功能[12]等。同时POLDIP2在中枢神经系统、肾脏、心血管疾病、肿瘤等多种生理和病理生理学中起到调节作用[11]。在哺乳动物中，POLDIP2蛋白的功能无法被其他蛋白质所补偿，因此POLDIP2基因的敲除对于胚胎是致命的[10,15]。但是，POLDIP2在上述生命活动中发挥作用的机制还没有完全阐明，而泛素化作为真核细胞中一种重要的蛋白质翻译后修饰，能够导致底物蛋白经由26S蛋白酶体降解或者调节蛋白质的生物学功能。因此，研究POLDIP2的泛素化，继而探究泛素化是否和POLDIP2在上述生理活动中发挥的功能相关，或许是探究其作用机制的一种方法。目前，关于POLDIP2的泛素化E3还没有任何报道，因此鉴定POLDIP2是否为E4B的底物具有非常重要的意义。

泛素连接酶E4B作为一种新型E3，同时也可以发挥E4的功能，从而介导底物蛋白质的降解[16]。目前已有许多关于E4B底物功能的研究，已确认E4B可以参与EGFR[17]、p53[18]等重要蛋白的泛素化降解。此外，E4B可以通过调节底物蛋白的泛素化参与多种癌症的发生发展，例如鼻咽癌[7]、肝细胞癌[19]、乳腺癌[20]和早幼粒细胞白血病[21]等。可见，探究E4B在真核细胞中的泛素化底物及探究其底物功能具有十分重要的意义。我们前期在正交泛素转移途径(OUT)中，通过质谱鉴定的方法发现POLDIP2可能是E4B的底物蛋白。在本研究中，我们通过在BL21中纯化POLDIP2蛋白，设置胞外泛素化反应，通过western blot鉴定出POLDIP2的泛素化smear条带，说明Ub可以通过E1-E2-E3级联反应传递至POLDIP2蛋白上。其次，我们通过鉴定HEK293细胞、E4B敲减稳转株(shE4B)、E4B过表达细胞株(E4B OE)中POLDIP2泛素化水平的强弱，证明了E4B蛋白水平和POLDIP2的泛素化水平呈正相关，再次证明POLDIP2是E4B的底物。再者，我们通过CHX Chase实验证明E4B可以加速POLDIP2的降解，并且随着E4B在细胞中转染量的增加，POLDIP2的蛋白水平不断降低，说明E4B可以介导POLDIP2的降解。

总的来说，本研究首次证明了泛素连接酶E4B能够将POLDIP2泛素化并介导其经由蛋白酶体降解。后续，我们将以POLDIP2的泛素化为基础，进一步在相应细胞模型和疾病模型中探究泛素化对于POLDIP2发挥功能的影响，并解释POLDIP2在某种生理活动中起作用的分子机制。